多组学分析揭示当归补血汤通过恢复造血谱系和重塑免疫微环境改善苯诱导的血虚证

《Chinese Medicine》：Multi-omics analysis reveals that Danggui Buxue decoction ameliorates benzene-induced blood deficiency syndrome via the restoration of hematopoietic lineage and remodeling of the immune microenvironment

　　

血虚证（Blood Deficiency Syndrome, BDS）是一种以造血功能障碍和免疫调节紊乱为特征的全身性疾病。鉴于当前疗法存在疗效单一和不良反应等局限性，迫切需要具有系统性调控作用的多靶点治疗药物。本研究通过慢性苯吸入建立BDS小鼠模型，采用整合转录组学和蛋白质组学方法，系统研究了当归补血汤（Danggui Buxue Decoction, DBD）的治疗机制。结果表明，DBD不仅显著恢复模型小鼠的体重、胸腺和脾脏指数以及骨髓微结构，还改善了外周血参数，如红细胞计数和平均红细胞体积。此外，DBD协同调节血清造血因子和炎性细胞因子水平。机制上，DBD通过双重途径发挥治疗作用：一方面，通过上调转铁蛋白受体（Transferrin Receptor, TFRC）促进铁依赖性红细胞生成，调节KITLG/FLT3LG维持干细胞库稳定性，并重编程整合素表达（如上调ITGA4和下调ITGA1）以促进干细胞归巢和抑制纤维化，从而促进造血修复；另一方面，通过增强MHC II类抗原呈递（如H2Aa、H2-Ab1、H2-DMb1和H2-Eb1）和免疫细胞活化（如CD22、CD37、CD20和CD8a），重塑免疫微环境，从而重建免疫稳态。本研究为DBD的多靶点和整体性调控特性提供了系统性分子基础，支持其临床应用，并为BDS相关疾病提供了潜在治疗靶点。

该研究聚焦于血虚证（Blood Deficiency Syndrome, BDS）的中医药治疗难题，系统阐释了经典名方当归补血汤（Danggui Buxue Decoction, DBD）发挥疗效的分子机制。血虚证在中医基础理论中是以面色苍白、头晕、心悸、视物模糊及月经失调等为特征的 fundamental syndrome，其核心病机在于血液生化不足或慢性耗损；在现代生物医学语境下，该证候的病理生理表现常与造血障碍和免疫失衡相重叠，可见于缺铁性贫血、再生障碍性贫血、化疗或苯暴露后的骨髓抑制以及慢性炎症性疾病等情形。当前西医治疗手段如铁剂补充、重组人促红细胞生成素（recombinant human Erythropoietin, rhEPO）及雄激素衍生物（如司坦唑醇）等虽有一定疗效，但存在疗效单一、血栓风险、肿瘤血管生成促进、肝毒性及男性化等显著不良反应，免疫抑制剂亦可导致骨质疏松和代谢紊乱。这些局限性凸显了开发更安全、具有系统性调控作用的多靶点治疗策略的紧迫性。中医药因其多成分、多靶点、协同治疗及低毒性的特点，在血虚证治疗中展现出巨大潜力。DBD作为首载于李东垣《内外伤辨惑论》（1247年）的经典方剂，由黄芪（Astragali Radix）与酒当归（Angelicae Sinensis Radix）按5:1质量比组成，临床确证对血虚证具有显著疗效，但其疗效缺乏系统性评价，分子机制的现代生物学阐释尤为不足，特别是靶点识别及"补血免疫"协同效应的调控机制尚不明确，制约了其精准应用与现代医学体系中的推广。

研究人员采用慢性苯吸入（500 ppm，8小时/天，4周）建立BDS小鼠模型，以模拟临床血虚证的渐进性造血和免疫功能障碍特征。实验设置对照组、模型组、DBD低中高剂量组（200、400、800 mg/kg）及阳性对照司坦唑醇组（0.78 mg/kg），灌胃给药4周。研究人员综合运用外周血细胞分析、免疫器官组织病理学检查、骨髓微结构观察、血清造血与炎症因子检测，并结合蛋白质组学（DIA技术，Orbitrap Astral质谱平台）和转录组学（Illumina NovaSeq 6000平台）的多组学整合分析策略，系统评价DBD的治疗效应并解析其分子机制。样本来源于辽宁长生生物技术有限公司提供的雄性CD1小鼠。

研究结果显示，DBD显著改善血虚证小鼠的造血功能并恢复外周血稳态。具体而言，DBD治疗逐步逆转苯暴露所致体重下降，显著提高胸腺和脾脏指数；外周血分析表明红细胞计数、平均红细胞体积（MCV）、平均血小板体积（MPV）、红细胞压积（HCT）和血小板压积（PCT）均显著恢复，接近正常生理范围。在造血和免疫器官的系统修复方面，DBD有效改善胸腺萎缩状态，改善皮质和髓质区淋巴细胞稀疏、皮髓质界模糊及间质纤维增生等病理改变；改善脾脏白髓脾小结萎缩、红髓局部增生等异常，使白髓和红髓界限清晰、分布均匀；恢复骨髓微环境中骨小梁均匀分布、支持多种发育期血细胞的网状细胞/纤维网络，减少巨核细胞、脂肪细胞和粒细胞浸润，增加血窦结构。

DBD协同调节血清造血因子和炎性细胞因子水平。研究测定显示，DBD显著升高血小板生成素（Thrombopoietin, TPO）血药浓度，同时显著降低白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）、粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF）和干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）水平，表明DBD兼具逆转"造血抑制"和"炎症过度激活"的双重治疗效应。

蛋白质组学分析揭示了DBD介导的造血谱系恢复和抗原呈递调控。苯诱导的BDS小鼠脾脏中出现828个蛋白异常高表达和797个蛋白低表达，核心造血过程如细胞分裂、DNA复制/修复及红细胞/B细胞分化显著下调，而细胞黏附/迁移、血管生成、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重组、抗菌/吞噬反应及谷胱甘肽代谢等代偿性过程上调。DBD-M组（中剂量组）蛋白质组学分析显示，650个蛋白显著上调、490个蛋白显著下调。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析表明DBD精准靶向病理特征：修复DNA损伤并重新激活停滞的细胞周期，通过上调DNA复制功能（起始、一般复制、解旋及减数分裂前复制）、增强双链断裂修复和DNA修复调控来恢复增殖能力；改善染色体稳定性（染色体调控、凝缩蛋白复合体、动粒）并重组复制机器（CMG/MCM/DNA复制因子C复合体、夹载、起点结合及单链DNA结合/解旋酶活性）；同时强化染色质调控（组蛋白/染色质结合和伴侣活性）及核维护功能。尤为关键的是，DBD直接靶向造血损伤核心病理，显著上调红细胞分化，分子层面验证了其补血功效。DBD还通过上调MHC II类复合物及其结合能力增强免疫识别，提示B细胞/树突状细胞的抗原呈递功能改善；并通过降低细胞黏附/迁移（细胞-基质黏附及整合素介导的信号转导）、ECM重塑（弹性纤维组装、含胶原ECM及胶原/整合素结合）和氧化应激（谷胱甘肽转移酶/过氧化物酶活性及谷胱甘肽结合）来抑制代偿性髓外造血、纤维化和氧化损伤。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析证实DBD上调DNA修复通路（碱基/核苷酸切除修复和错配修复）、通过DNA复制通路激活细胞周期、上调造血细胞谱系以恢复血细胞增殖分化；同时下调细胞色素P450代谢以减轻外源解毒负担，抑制ECM受体相互作用、黏着斑和PI3K/Akt信号通路以逆转病理性重塑。

转录组学分析进一步验证并深化了上述双重机制。DBD处理组与模型组相比，显著上调4123个基因、下调2190个基因。GO分析显示DBD显著上调抗原结合α/β链及MHC II类抗原呈递相关基因簇（包括H2-Aa、H2-Ab1、H2-DMa、H2-DMb1和H2-Eb1），增强抗原呈递细胞功能；并行激活B细胞和T细胞网络以实现免疫微环境重塑。机制上，DBD上调Cd22和Cd37调控B细胞信号，增加Cr2介导的补体内化，上调Cd8a和Cd8b放大细胞毒性T细胞反应，增加FCER2表达调控B细胞分化，并促进Ms4a1阳性B细胞活化。KEGG分析揭示DBD通过下调Kitlg（干细胞因子，Stem Cell Factor, SCF）和FLT3LG精细调控干细胞稳态，防止造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）过度分化耗竭；同时上调ITGA4（整合素α4）促进VCAM-1⁺归巢，下调Itga1抑制胶原结合和纤维化进展。蛋白质免疫印迹实验确认了这些分析结果。

综合转录组学分析，DBD主要通过两大相互关联的机制发挥治疗效应：在造血谱系修复方面，DBD上调TFRC以促进红细胞前体扩增和铁依赖性红细胞生成，下调Kitlg和Flt3lg以防止造血干细胞过度耗竭，从而维持干细胞库的可持续性；同时上调ITGA4和下调ITGA1协同促进干细胞归巢、抑制纤维化进展并保护生理造血微环境。在免疫微环境重塑方面，DBD增强MHC II类基因家族成员表达，强化MHC II介导的抗原呈递，促进T/B细胞活化，实现免疫微环境的全面重塑和造血生长因子分泌增加，最终恢复免疫功能。

研究讨论部分深入阐释了DBD多靶点调控的科学内涵。研究人员指出，造血细胞谱系是造血干细胞分化为红细胞、粒细胞、巨核细胞/血小板和淋巴细胞（B/T细胞）的核心通路，苯代谢产物通过干扰DNA复制和修复抑制该通路中红细胞分化和B细胞分化的关键环节，导致外周血异常。DBD通过激活DNA复制、碱基/核苷酸切除修复，解除细胞周期阻滞，恢复多谱系造血细胞分化能力，从而从源头上逆转造血衰竭。MHC II类蛋白复合物由抗原递呈细胞表达，其功能依赖于h2-aa/h2-ab1（编码抗原结合沟槽α/β链）和h2-dma/h2-dmb1/h2-eb1（编码分子伴侣）基因簇的共表达；DBD显著上调这些基因，促进MHC II抗原肽复合物组装和呈递，增强T细胞活化，不仅改善模型小鼠低下的免疫识别功能，还通过免疫细胞分泌造血因子（如GM-CSF）间接促进造血微环境恢复，调节"免疫-造血"交叉对话。TFRC作为红细胞前体细胞铁摄取的核心开关，介导转铁蛋白-铁复合物内吞，直接驱动血红蛋白合成和红细胞成熟；DBD显著上调TFRC，改善血虚证红细胞分化障碍，提升红细胞和血红蛋白水平，改善携氧功能以缓解面色苍白和疲乏。KIT配体（KITLG，又称SCF）通过结合并激活细胞表面酪氨酸激酶受体c-Kit发挥多功能调控作用，维持造血干细胞自我更新；苯毒性导致c-Kit信号过度活跃，DBD下调KITLG以防止造血干细胞过度耗耗竭。FLT3配体（FLT3LG）促进淋巴祖细胞增殖分化，DBD协同下调FLT3LG与KITLG，防止造血干细胞耗竭及淋巴系统过度激活所致的炎症失衡。整合素α4（ITGA4）介导造血干细胞与骨髓/脾脏VCAM-1⁺微环境的结合，而整合素α1（ITGA1）介导造血干细胞与胶原基质的异常黏附促进纤维化；DBD特异性上调ITGA4、下调ITGA1，促进造血干细胞归巢，加速造血功能修复，抑制脾脏和骨髓纤维化及胶原沉积，保护正常造血空间。

研究结论指出，DBD对苯诱导的血虚证具有显著治疗效果，有效恢复造血功能，使外周血参数正常化，修复胸腺、脾脏和骨髓的病理损伤，并减轻炎症反应。机制上，多组学数据表明DBD可能通过造血谱系修复和免疫微环境重塑的协同机制发挥作用：具体而言，通过上调TFRC促进铁依赖性红细胞生成，下调KITLG和FLT3LG协调干细胞库保护以确保造血可持续性，调控ITGA4(↑)/ITGA1(↓)以增加干细胞归巢、抑制纤维化并保护生理造血微环境；此外，DBD增强MHC II类抗原呈递和免疫细胞活化，促进免疫稳态并调节血虚证中的代偿性应激反应。这些发现不仅在分子水平上支持了这一经典方剂的补血功能，还展示了其对抗苯诱导造血衰竭的整体调节能力。已鉴定的靶点和通路为DBD的临床应用提供了机制基础，并为血虚证及相关造血-免疫障碍建立了可转化的治疗范式。该论文发表于《Chinese Medicine》。