《Chinese Medicine》：Ya Han Jie ameliorates adjuvant-induced arthritis by inhibiting the NF-κB/NETosis/inflammation axis
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类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种主要累及关节的慢性自身免疫性疾病。雅罕解（Ya Han Jie, YHJ）是傣族医药中具有显著治疗RA疗效的药物，但其活性成分及治疗RA的潜在机制尚待阐明。本研究旨在探讨YHJ对RA的作用及
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种主要累及关节的慢性自身免疫性疾病。雅罕解（Ya Han Jie, YHJ）是傣族医药中具有显著治疗RA疗效的药物，但其活性成分及治疗RA的潜在机制尚待阐明。本研究旨在探讨YHJ对RA的作用及其潜在治疗机制。研究人员向小鼠关节腔内注射弗氏完全佐剂（Freund's Complete Adjuvant, FCA）建立佐剂诱导性关节炎（Adjuvant-Induced Arthritis, AA）模型，评估YHJ对RA的治疗作用及安全性。首先，测量小鼠关节直径以评估YHJ对关节肿胀程度的影响；其次，通过苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, H&E）染色和番红O-固绿（Safranin O-fast green）染色评估YHJ对AA小鼠关节病理变化的影响；随后，运用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术鉴定YHJ中作用于RA的活性成分，并通过RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）探索YHJ治疗RA的机制；此外，利用踝关节组织切片和纯化中性粒细胞评估YHJ对中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的影响；最后，通过16S rDNA测序评估YHJ对AA小鼠肠道菌群的影响。YHJ显著减轻AA小鼠的关节肿胀、关节炎评分及滑膜炎相关病理改变，抑制肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、白细胞介素-17A（Interleukin-17A, IL-17A）和干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）的表达。超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF MS/MS）鉴定出YHJ中的104种化合物，主要为氨基糖、糖苷、生物碱和萜类。网络药理学筛选出YHJ治疗RA的潜在靶点和信号通路，转录组学分析揭示YHJ下调与NET形成相关的基因；体内外实验进一步证实YHJ显著抑制NET形成。YHJ通过降低NF-κB的磷酸化和活化、减少NET形成相关蛋白的表达、抑制NET形成及炎症因子的释放，在体内外均对AA小鼠具有显著的治疗作用。
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以关节慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，全球患病率约为0.5%至1%，女性发病率约为男性的2至3倍，发病高峰年龄为50至59岁。RA不仅造成患者关节结构破坏和功能丧失，还带来沉重的社会经济负担。中性粒细胞在RA的发生发展中扮演关键角色，其活化后形成的中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）含有瓜氨酸化组蛋白，可作为自身抗原来源促进类风湿自身抗体的产生，进而加剧炎症反应和组织损伤。因此，抑制中性粒细胞过度活化或NETs过度生成成为治疗RA的重要策略。雅罕解（Ya Han Jie, YHJ）是傣族医药经典方剂，由大叶火筒树（Leea macrophylla Roxb. ex Hornem.）、石吊兰（Lysionotus pauciflorus Maxim.）、滇刺枣（Ziziphus oenopolia (L.) Mill.）和延胡索（Corydalis yanhusuo W.T. Wang）四味药材组成，在临床上广泛用于风湿痹痛的治疗，但其化学成分基础和分子机制尚不明确。
研究人员开展此项研究旨在系统阐明YHJ治疗RA的物质基础及其作用机制。通过构建佐剂诱导性关节炎（Adjuvant-Induced Arthritis, AA）小鼠模型，结合多组学技术和体内外实验验证，研究人员发现YHJ通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路进而调控NETosis过程，最终发挥抗RA效应。该论文发表于《Chinese Medicine》。
研究采用的主要关键技术方法包括：构建FCA诱导的AA小鼠模型并进行YHJ灌胃给药干预；应用UPLC-Q-TOF MS/MS结合GNPS分子网络分析进行化学成分鉴定；运用SwissADME、SwissTargetPrediction和DisGeNET数据库进行网络药理学分析；通过AutoDock Vina进行分子对接，采用GROMACS 2020软件进行100 ns分子动力学模拟；对骨髓中性粒细胞进行RNA-seq转录组测序及Mfuzz聚类分析；采用免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）、多重免疫组织化学（multiplex IHC, mIHC）、蛋白免疫印迹（Western Blot, WB）及酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测相关蛋白表达和炎症因子水平；通过 Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠腹腔中性粒细胞进行体外NETosis诱导实验。
研究结果显示，YHJ显著改善AA小鼠的RA症状。通过测量踝关节直径和关节炎评分，发现YHJ处理显著减轻关节肿胀，且呈现剂量依赖性。组织病理学分析表明，YHJ减少滑膜炎症细胞浸润、骨破坏和软骨损伤。血清炎症因子检测显示，YHJ降低TNF-α、IL-6、IL-17A和IFN-γ水平。安全性评估显示YHJ未引起明显肝肾功能损伤。
化学成分分析方面，UPLC-Q-TOF MS/MS鉴定出YHJ中104种化合物，GNPS分子网络分析显示其主要为氨基糖、糖苷、生物碱和少量萜类化合物。网络药理学分析从881个潜在化合物靶点和221个RA相关靶点中筛选出44个交集靶点，蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络揭示TNF-α、STAT3、PTGS2、CXCR4和IL2为核心靶点。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析提示YHJ作用于趋化因子信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路和JAK-STAT信号通路等。
转录组学分析显示，与AA组相比，YHJ组有123个差异表达基因，其中86个上调、37个下调。Mfuzz聚类分析揭示YHJ显著下调NET形成相关基因和白细胞跨内皮迁移相关基因，同时下调IL-17信号通路相关基因。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析表明差异表达基因富集于蛋白结合、RNA结合、钙黏蛋白结合等分子功能，以及翻译、细胞形态调控等生物学过程。
在NET形成抑制方面，体内实验通过mIHC检测显示YHJ显著降低关节组织中中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase, NE）、肽基精氨酸脱亚胺酶4（Peptidylarginine Deiminase 4, PAD4）和瓜氨酸化组蛋白H3（Citrullinated Histone H3, CitH3）的表达水平；血清MPO-DNA复合物水平检测证实YHJ降低循环NETs水平。体外实验中，YHJ含药血清预处理可抑制PMA诱导的原代中性粒细胞NETosis，表现为NE信号减弱和细胞核形态改善。此外，PAD4抑制剂GSK484处理也能显著改善AA小鼠关节症状，进一步验证NETs作为RA治疗靶点的可行性。
在TNF-α/NF-κB信号通路调控方面，IHC检测显示YHJ降低关节滑膜组织中IL-6、TNF-α、TNF受体1（TNF-R1）、磷酸化IκBα（p-IκBα）和磷酸化P65（p-P65，即p-NF-κB）的蛋白水平；WB结果证实YHJ下调关节组织中STAT3和PAD4的蛋白表达。功能验证实验采用外源性重组TNF-α蛋白刺激中性粒细胞，结果显示TNF-α单独刺激可诱导早期NETosis变化，与PMA共刺激则显著增强NETosis程度，表现为CitH3荧光强度和DAPI面积均显著增加，证实TNF-α/NF-κB轴是NETosis的功能性驱动因素。
分子动力学模拟方面，对YHJ中4个与TNF-α结合亲和力最强的化合物（YHJ013、YHJ015、YHJ018、YHJ022）进行100 ns模拟，结果显示所有化合物均能与TNF-α形成稳定的氢键相互作用，平均结合能低于-200 kJ/mol，均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）在模拟过程中保持较小范围，提示这些化合物与TNF-α具有稳定的结合能力。
讨论部分，研究人员综合上述结果强调：RA早期中性粒细胞浸润和NET形成是关键致病环节，NETs通过激活周围细胞释放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子加剧关节损伤；YHJ通过多成分、多靶点、多通路协同作用，核心机制在于抑制TNF-α/NF-κB信号通路活化，进而下调PAD4等NET形成相关蛋白表达，最终抑制NETosis和炎症因子释放；RNA-seq和网络药理学的整合应用为揭示民族药物复杂作用机制提供了有效范式；该研究为YHJ的临床应用提供了坚实的实验依据，也为开发基于NETosis调控的RA治疗新策略提供了参考。
研究结论：YHJ通过抑制NF-κB活化、减少NET形成相关蛋白表达、抑制NET形成及炎症因子释放，在体内外均对AA小鼠发挥显著治疗作用。
