《Archives of Virology》：Molecular surveillance and genomic characterization of enterovirus D68 in southern Portugal, 2024–2025
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肠道病毒D68（Enterovirus D68, EV-D68）是一种再次出现的呼吸道病原体， increasingly与严重呼吸道疾病及偶发的神经系统并发症相关，然而其在葡萄牙的流行情况仍缺乏充分记录。在本研究中，研究人员调查了2024年10月至2025年2
肠道病毒D68（Enterovirus D68, EV-D68）是一种再次出现的呼吸道病原体， increasingly与严重呼吸道疾病及偶发的神经系统并发症相关，然而其在葡萄牙的流行情况仍缺乏充分记录。在本研究中，研究人员调查了2024年10月至2025年2月期间收集于葡萄牙南部（阿尔加维地区）呼吸道样本中EV-D68的存在情况。对150份先前鼻病毒/肠道病毒阳性的患者呼吸道样本进行筛查（115份来自儿童，35份来自成人），发现8例EV-D68阳性病例，对应检出率为5.44%，年龄范围涵盖婴儿至老年。临床表现从轻症呼吸道疾病到重症不等，包括肺炎和急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS）。EV-D68阳性患者中还观察到神经系统表现，包括复杂性热性惊厥和脑脊髓炎。部分病例存在合并感染，而另一些病例则仅检出EV-D68作为唯一呼吸道病原体。一株分离株的基因组特征分析显示其VP1片段属于B3分支，另一株分离株的完整基因组则聚类于A2分支。系统发育分析证实其与当代欧洲分离株聚类。这些发现为葡萄牙南部EV-D68的检出提供了初步证据，并记录了所表征样本中A2和B3分支的存在。研究结果展示了受感染患者中观察到的异质性临床表现，并强调了持续进行EV-D68分子监测和基因组特征分析的价值。
EV-D68是一种再次出现的非脊髓灰质炎肠道病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae），1962年首次分离，主要引起呼吸道疾病，但越来越多地与严重下呼吸道疾病相关，少数情况下还可导致急性弛缓性脊髓炎（Acute Flaccid Myelitis, AFM）等神经系统并发症。历史上，EV-D68仅引起散发病例或小规模急性呼吸道疾病聚集性疫情，但约从2014年起，北美和欧洲陆续报道了多起大规模急性呼吸道疾病暴发。这些暴发不仅显示出儿童中呼吸道疾病病例数的升高，还出现了偶发的神经系统表现，引发了对病毒进化、多样性及监测空白的担忧。分子研究促进了对EV-D68基因型和分支结构的理解，目前已鉴定出A、B、C、D四个主要分支，部分分支进一步细分出亚分支（A1、A2、B1、B2、B3、D1、D2），其中B3等亚分支近年来尤为突出。然而，由于许多地区仍缺乏完整基因组测序数据，限制了除VP1等高度可变区域外对病毒进化、传播动态及潜在重组或突变事件的解析。VP1区域编码主要衣壳蛋白，是肠道病毒分类、分子分型和系统发育分析的主要基因组靶标，因其遗传变异性和抗原相关性而被广泛应用。
欧洲非脊髓灰质炎肠道病毒网络（European Non-Polio Enterovirus Network, ENPEN）的研究显示，2021–2022年秋季至冬季季节欧洲EV-D68病例数显著增加，常见严重急性呼吸窘迫，多伴有发热，部分病例出现包括幼儿AFM在内的神经系统并发症，同时B3衍生谱系出现。此外，EV-D68的持续流行及B3衍生谱系的进化（包括新的氨基酸替换）展示了该病毒的快速适应能力，即使在被认为病毒活动较低的时期仍持续发生遗传多样化，这一现象已再次在欧洲、美国及部分亚洲地区得到记录。这些发现指向了持续的遗传多样化以及加强协调统一检测和监测的必要性。
在葡萄牙，EV-D68的流行或遗传多样性仍 largely未获表征。为填补这一空白，研究人员于2024年10月至2025年2月在葡萄牙南部（阿尔加维地区）开展了一项研究，筛选因急性及严重呼吸道感染就诊于急诊科或需住院治疗的儿童和成人患者鼻咽样本，这些样本先前经鼻病毒/肠道病毒（Rhinovirus/Enterovirus, RV/EV）检测呈阳性，旨在检测其中EV-D68的存在，并通过VP1区域扩增及尽可能进行的完整基因组测序对鉴定出的EV-D68分离株进行基因组水平的特征分析。本研究通过所鉴定分离株的系统发育分析，为葡萄牙EV-D68的检测和遗传特征分析补充了额外数据。
研究样本来源于2024年10月至2025年2月期间在葡萄牙阿尔加维法鲁医院（Unidade Hospitalar de Faro）因急性及严重呼吸道感染就诊于急诊科或住院治疗的115例儿童和35例成人，共计150例患者。所有样本均通过BioFire? FilmArray? Respiratory 2.1 Panel（BioMérieux）检测RV/EV阳性。鼻咽拭子样本采集后保存于病毒运输液中，?80°C冻存直至进一步处理。合并感染的其他呼吸道病毒和病原体由医院诊断团队基于常规临床检测（包括可用的BioFire? FilmArray? Respiratory 2.1 Panel）报告，细菌检测仅在临床指征时进行并从病历中提取。
研究人员采用实时逆转录聚合酶链式反应（Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）对150份RV/EV阳性样本进行EV-D68 RNA筛选，靶标为VP1区域约94 bp片段；通过巢式PCR扩增所有EV-D68阳性样本的VP1区域（约590 bp）以获得测序所需的基因片段；对RT-qPCR阳性样本采用序列非依赖性单引物扩增（Sequence-Independent Single-Primer Amplification, SISPA）结合牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）PromethION 24平台进行全基因组测序，文库制备采用Native Barcoding Kit 96 V14。生物信息学分析涵盖：使用ont-dorado-for-promethion进行碱基识别，Porechop去除接头和条形码，Kraken2进行物种分类，Minimap2进行序列比对，Samtools处理BAM文件，Python脚本计算基因组覆盖度，BLASTn验证病毒身份及评估序列相似性。系统发育分析采用MAFFT进行多序列比对，IQ-TREE构建最大似然树，iTOL平台进行可视化。重组分析使用RDP4的RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan及3Seq七种方法，并以SimPlot++进行相似性作图分析。
**EV/RV阳性患者的人口学和临床特征**
研究纳入的150例患者均为RV/EV阳性，包括115例儿童和35例成人。儿童年龄范围为1周至17岁，中位年龄12个月，平均年龄约2岁7个月，男性居多（n=75）。成人年龄范围为20至100岁，中位年龄58岁，平均年龄约60岁2个月，其中男性19例，女性16例。儿童最常见的临床表现为发热（n=39）、咳嗽（n=14）、毛细支气管炎（n=7）、支气管痉挛（n=5）和哮喘（n=5）；严重表现包括ARDS（n=1）、复杂性热性惊厥（n=1）及自身免疫性脑炎（n=1）。成人最常见表现为肺炎（n=5）、发热（n=3）、毛细支气管炎（n=1）、咳嗽（n=1）、呼吸困难（n=2）、哮喘或慢性肺病（n=2）；严重表现包括低钙血症（n=1）、糖尿病酮症酸中毒（n=1）、中性粒细胞减少伴发热（n=1）及免疫抑制（n=2）。部分患者存在其他呼吸道病毒合并感染，包括腺病毒（n=22）、呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV）（n=8）、副流感病毒1–3型（n=8）、甲型流感病毒H1和H3（n=5）、乙型流感病毒（n=4）、冠状病毒NL63（n=3）和OC43（n=3）、人偏肺病毒（n=3）及SARS-CoV-2（n=1）。
**EV-D68阳性患者的人口学和临床特征**
150份RV/EV阳性样本中，8例EV-D68阳性，其中儿童5例，成人3例。EV-D68阳性儿童年龄分别为8个月、1岁、2岁（两例）和8岁，男性4例，女性1例。3例儿童存在EV-D68与腺病毒合并感染，其中1例同时合并RSV感染并出现复杂性热性惊厥。值得注意的是，两例病情最严重的儿童（一例ARDS，一例全球呼吸衰竭需有创通气、嗜睡及脑脊髓炎）均未检测到病毒合并感染，EV-D68是唯一检出的呼吸道病毒。EV-D68阳性成人年龄分别为68岁、80岁和95岁，男性2例，女性1例，该组未识别出合并感染，临床诊断包括气管支气管炎、肺炎、全球呼吸衰竭，1例报告下肢无力。
**EV-D68毒株分析**
对8例EV-D68阳性样本进行VP1区域巢式PCR扩增，仅1例来自2岁患儿的样本获得可分析的VP1基因片段（GenBank登录号：PX277134）。通过SISPA方案，从8例阳性样本中成功获得1例完整EV-D68基因组，来自68岁患者（GenBank登录号：PV418226）。两例成功表征的样本RT-qPCR Ct值均较低（部分VP1序列Ct=21.50，完整基因组Ct=19.46），提示较高病毒RNA水平可能促进了测序成功。组装基因组深度覆盖度分析显示基因组大部分区域覆盖度高且相对均一，足以确保一致性序列生成的高置信度。
构建了三棵系统发育树以确定所获序列的进化定位。基于完整VP1基因构建的树显示，儿童样本来源的VP1片段（PX277134）聚类于B分支B3亚分支，而成人样本来源的完整基因组VP1区域（PV418226）聚类于A分支A2亚分支。基于代表性序列子集构建的简化VP1树及包含所有可用完整基因组的完整基因组树均确认了这一定位。完整基因组系统发育分析显示，PV418226与来自法国（PQ612569，核苷酸一致性99.57%）和美国的EV-D68完整基因组（PV624835、PV178657，核苷酸一致性99.33%–99.39%）聚类。RDP4分析未在恢复的完整基因组中检测到支持的重组事件，5'UTR、P1、P2和P3区域系统发育推断显示稳定聚类于A2分支，相似性作图分析未显示嵌合基因组结构证据。
**讨论**
本研究讨论了EV-D68作为再次出现呼吸道病原体的公共卫生意义，其在葡萄牙的检测和基因组特征分析为这一伊比利亚半岛南部地区的EV-D68补充了基因组数据。150例患者中8例EV-D68阳性，检出率5.44%，患者年龄范围广，临床表现异质性高。儿童表现包括ARDS、呼吸困难、支气管痉挛、复杂性热性惊厥及脑脊髓炎；成人表现包括肺炎伴全球呼吸衰竭、严重疲劳伴下肢无力及气管支气管炎伴低氧性呼吸衰竭。这些临床谱与国际报道一致，即EV-D68可引起从轻微疾病到严重呼吸衰竭的连续疾病谱，儿童尤为如此，哮喘或慢性肺病等基础疾病患者风险更高。神经系统并发症虽少见但已有记录，强化了该病毒的神经侵袭潜力。成人临床表现同样以呼吸道为主，老年患者及合并基础疾病者严重程度更高。鉴于EV-D68阳性病例数少且存在合并感染，本研究无法推断EV-D68感染与临床严重程度之间的因果关系。
分子特征分析显示两例分离株具有不同遗传谱系：2岁患儿来源的VP1片段属于B3亚分支，68岁成人来源的完整基因组属于A2亚分支。据Nextstrain近六年数据，A2亚分支主要在西班牙、法国和意大利检出，后者为最接近的相关序列。仅1例样本获得适合Sanger测序的VP1扩增子，可能归因于样本间RNA质量和扩增效率差异；而SISPA方法成功获得完整基因组，支持其在EV-D68基因组特征分析中的实用价值。A2基因组的重组分析未检测到重组证据。
这些结果为葡萄牙检测到的EV-D68提供了初步系统发育特征，与2017年以来仅B3和A2/D2基因型持续在欧洲、亚洲及美国流行的研究一致。阿尔加维地区作为国际旅游目的地，可能促进多样化EV-D68毒株的输入和传播，强调了在人口高流动性地区持续监测的重要性。A2完整基因组与B3 VP1片段的鉴定符合欧洲近期趋势：B3为优势谱系，同时A2持续流行。这些发现指示了与近期报道的欧洲和北美A2毒株的密切遗传相关性。有趣的是，B3亚分支主要与儿童感染相关（中位年龄5岁），而A2更常见于成人（中位年龄42岁），这一模式与本研究有限观察数据一致。与其他欧洲研究相比，5.44%的检出率处于相似范围，可能归因于使用了RV/EV阳性样本。需注意的是，由于仅纳入既往RV/EV阳性样本，该检出率反映的是预筛选队列中EV-D68的频率，而非所有呼吸道感染患者中的流行率，这种靶向抽样策略可能引入选择偏倚。
抗原进化仍是关注点，尤其是VP1环区及其他表面暴露蛋白区域的氨基酸替换。欧洲监测已证明这些突变可在免疫压力下快速积累，潜在改变中和特征和人群易感性。未来需结合更广泛测序、表位定位和血清学检测，以评估葡萄牙分离株是否显示免疫逃逸或致病性改变迹象。
研究的公共卫生意义包括：证实EV-D68在研究期间存在于葡萄牙南部，支持持续监测的必要性；扩展基于序列的监测可改善对葡萄牙EV-D68遗传多样性和分支分布的理解，因PCR检测 alone无法提供追踪输入、分支转换或进化动态所需的分辨率；整合分子数据与临床流行病学信息对于确定A2和B3亚分支感染在葡萄牙是否呈现不同的严重程度或年龄分布至关重要；鉴于EV-D68快速的跨境混合能力，与欧洲伙伴持续协作共享数据必不可少，这对接收非洲移民流的葡萄牙南部地区尤为相关。
研究局限性包括：季节限制和地理局限至阿尔加维地区，无法评估国家级趋势或长期进化动态；仅恢复1例VP1序列和1例完整基因组，限制了关于分支流行和年龄相关分布模式的更广泛推断。
**研究结论**
本研究记录了葡萄牙南部呼吸道样本中EV-D68的检测情况，包括在所表征样本中检测到A2和B3分支，这些分支也已在欧洲其他地区流行。这些发现支持持续分子监测、扩展基因组特征分析，以及整合临床和流行病学数据以更好评估EV-D68在葡萄牙的潜在疾病负担和公共卫生意义的价值。
