蝙蝠冠状病毒检测及全基因组特征分析——来自加纳的研究

《Archives of Virology》：Detection and complete genome characterisation of bat coronaviruses from Ghana

　　

摘要 甲型冠状病毒（Alphacoronavirus，AlphaCoV）包含具有重要经济与公共卫生意义的人类和动物冠状病毒，尤其在全球畜牧业中影响显著。家畜因其与人类及野生动物的接触，可能成为冠状病毒的中间宿主。本研究旨在建立一种筛查逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法，用于检测和全基因组测序已知但尚未被发现的AlphaCoV以及新型病毒。研究人员合成了两种人类AlphaCoV的体外转录RNA，用于评估检测性能，并对存档的蝙蝠及家畜病毒RNA样本进行了验证检测。阳性结果经桑格测序和高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）确认后，进行系统发育分析。该检测方法的灵敏度为：对人类AlphaCoV的体外转录模板，阿姆斯特丹型AlphaCoV（Alphacoronavirus amsterdamense）的检测限为46拷贝/反应，芝加哥型AlphaCoV（Alphacoronavirus chicagoense）为504拷贝/反应，由概率单位回归分析确定。在家畜及半家养牲畜（包括牛、羊、山羊、驴、猪、兔及草豚）样本中未检测到阳性结果，但在蝙蝠样本中总体检出率为3.11%，其中AlphaCoV占1.84%，BetaCoV占1.27%。研究人员获得了两个完整基因组，分别为与芝加哥型AlphaCoV相关的蝙蝠冠状病毒及属于Hibecovirus亚属的潜在成员；还获得了一个近完整的Chaerephon属蝙蝠AlphaCoV基因组，该病毒与尼日利亚类似病毒亲缘关系最近。本研究提供了一种高灵敏度冠状病毒监测方法，并丰富了冠状病毒多样性认知。

论文解读

研究背景与意义

冠状病毒（Coronavirus）为正链RNA病毒，基因组长度约24–32 kb，可感染哺乳动物与鸟类，分为AlphaCoV、BetaCoV、GammaCoV和DeltaCoV四个属。BetaCoV中的大流行冠状病毒（Betacoronavirus pandemicum）和中东呼吸综合征冠状病毒（Betacoronavirus cameli）曾造成全球疫情，AlphaCoV同样包含人畜共患病毒，如引起普通感冒的人类冠状病毒NL63（Alphacoronavirus amsterdamense）与229E（Alphacoronavirus chicagoense）。猪流行性腹泻病毒（Alphacoronavirus porci）等动物AlphaCoV在畜牧业中造成重大经济损失。蝙蝠被认为是多种冠状病毒的自然宿主，但非洲地区尤其是加纳的完整基因组数据匮乏，限制了对其演化与传播风险的评估。因此，研究人员开展了针对AlphaCoV的高灵敏度RT-PCR检测及全基因组测序研究，以填补这一空白。该研究发表于《Archives of Virology》。

主要技术方法

研究人员下载并筛选了1122条AlphaCoV基因组序列，以高度保守的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp，nsp12）区域为靶标设计简并引物，并合成两种人类AlphaCoV的体外转录RNA作为定量对照。建立了半巢式RT-PCR检测方法，并通过概率单位回归分析确定检测限。研究使用了加纳2008–2009年的蝙蝠粪便样本（706份）和2015–2021年的家畜存档RNA样本（388份）进行验证。阳性扩增产物经桑格测序确认，部分样本进行高通量测序，利用参考基因组进行拼接与注释，并通过最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树，同时按国际病毒分类委员会（ICTV）标准进行病毒分类。

研究结果

检测性能评估

半巢式RT-PCR对阿姆斯特丹型AlphaCoV的检测限为46拷贝/反应，芝加哥型AlphaCoV为504拷贝/反应。体外与生物信息学分析显示，引物在AlphaCoV中具有广泛覆盖性，对部分BetaCoV也有潜在结合能力。

样本检测结果

家畜样本均为阴性；蝙蝠样本总阳性率为5.1%（36/706），经测序确认22份为冠状病毒阳性（3.11%），其中AlphaCoV占1.84%，BetaCoV占1.27%。阳性病毒主要来自Hipposideros属蝙蝠，并与肯尼亚、南非等地病毒株具有高度同源性。

全基因组解析

获得PP182442（芝加哥型AlphaCoV相关）完整基因组长28,757 bp，PP182443（BetaCoV）完整基因组长30,123 bp，以及PP182444（Chaerephon属AlphaCoV）近完整基因组长27,841 bp。三者的基因组结构均符合典型冠状病毒布局，包括ORF1ab、刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N），并带有不同数量的辅助开放阅读框（ORF）。

系统发育与分类

PP182442与2011年加纳分离株亲缘关系最近（同源性94.19%）；PP182444与尼日利亚Mops condylurus AlphaCoV亲缘最近（同源性95.3%）；PP182443与Hibecovirus亚属唯一已知物种Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang2013聚为一支，并在多个复制酶保守域中显示出较高的氨基酸同源性（如nsp13为90%）。与亚洲毒株相比，PP182443缺少表面蛋白编码区（SP）和ORF8，但具有独特的ORF6，体现出显著的地理分化。

讨论与结论

研究建立的RT-PCR方法兼具高灵敏度与广谱性，可有效用于AlphaCoV监测，尤其适用于低病毒载量的自然宿主样本。家畜样本未检出冠状病毒可能与样本量不足、混合检测稀释效应及采样时间有关。蝙蝠AlphaCoV在非洲分布广泛，且Chaerephon属蝙蝠与人类居住环境接近，增加了溢出风险。Hibecovirus亚属病毒与SARS相关BetaCoV亲缘较近，具有重要的进化与公共卫生意义。本研究获得的基因组填补了非洲BetaCoV尤其是Hibecovirus的数据空白，揭示了地理分化特征，强调了扩大非洲蝙蝠及其他野生动物冠状病毒基因组监测的重要性。

结论认为，该筛查方法在冠状病毒界面监测中具有应用潜力，所获取的完整及近完整基因组加深了对非洲冠状病毒多样性和演化动态的理解，为未来的风险评估与防控策略提供了科学依据。