BOLD-100/KP1339与已确立化疗药物在胃肠道多细胞肿瘤球体中的联合研究

《Cancer Chemotherapy and Pharmacology》：Combinational studies of BOLD-100/KP1339 with established chemotherapeutics in gastrointestinal multicellular tumor spheroids

　　

BOLD-100是一种钌（ruthenium）(III)前药，也称为KP1339，目前正在临床研究中评估其作为协同治疗抗癌药物的适用性。与铂类化疗药物不同，BOLD-100具有独特的非DNA靶点，主要作用于葡萄糖调节蛋白78（GRP78），这是一种负责内质网（ER）蛋白折叠相关信号传导的酶。抑制这一“未折叠蛋白反应”（UPR）的关键介质，最终可能导致细胞死亡。本研究旨在于体外评估BOLD-100与奥沙利铂、5-FU、顺铂或SN38联用时，相较于单药处理对多细胞肿瘤球体（MCTSs）的影响。研究人员选用了胃癌细胞系MKN45、NCI-N87以及结直肠癌细胞系HCT116、HT29，这与当前正在治疗此类来源肿瘤患者的临床试验相对应。本研究考察的生物学效应包括细胞毒活性、基于Chou和Talalay算法的协同/拮抗作用、活性氧（ROS）的形成，以及细胞凋亡和坏死的诱导。细胞毒性检测显示，即使在相同肿瘤来源的MCTSs中，化疗敏感性也存在显著差异。在两类肿瘤中，当BOLD-100与上述药物联合时，均观察到部分协同效应。二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测提示，奥沙利铂处理后，以及在一定限制条件下其与BOLD-100联用后，ROS水平均持续升高。单药和联合处理均可在球体模型中诱导细胞凋亡和坏死，且在联合处理条件下未见拮抗迹象。总之，这些发现强调了BOLD-100在胃癌和结直肠癌联合治疗中的潜力。

该文发表于《Cancer Chemotherapy and Pharmacology》，围绕钌（Ru）(III)前药BOLD-100/KP1339与标准化疗药物在胃肠道肿瘤三维模型中的联合应用潜力展开。研究背景在于，尽管铂类等细胞毒药物仍是实体瘤治疗的重要基础，但其非特异性毒性显著，且单药治疗易受耐药性限制，因此开发作用机制互补、毒性谱不重叠的联合治疗策略具有明确临床价值。BOLD-100作为一种以非DNA靶点为主的钌基前药，与主要作用于核酸的传统化疗药不同，其可干扰内质网（ER）稳态、抑制分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78），进而影响未折叠蛋白反应（UPR），并干预糖酵解及核糖体生物发生。鉴于其机制独特、与标准细胞毒药物毒性重叠较少，研究人员将其视为联合治疗的优选候选药物。特别是在临床II期研究中，BOLD-100已与FOLFOX方案联用并显示出一定前景，因此有必要在更接近体内状态的三维多细胞肿瘤球体（MCTSs）模型中系统评价其与常用胃肠道化疗药物联用的基础药理学效应。

为开展本研究，研究人员建立了4种胃肠道肿瘤细胞系来源的MCTSs模型，包括胃癌MKN45、N87及结直肠癌HCT116、HT29；采用共聚焦显微镜结合KI67和HIF-1α免疫荧光表征球体增殖与缺氧状态；以resazurin法测定单药及联合用药细胞毒性并计算IC₅₀；应用Chou-Talalay算法和CompuSyn软件评估协同/拮抗作用；以DCFH-DA法检测ROS变化；采用annexin V/PI流式细胞术分析凋亡与坏死。样本来源均为既有商业或研究机构提供的人肿瘤细胞系，无患者队列。

研究首先解决的是模型构建与适用性问题。

Formation of multicellular tumor spheroids
研究人员比较了不同接种密度下4种细胞系形成MCTSs的能力，以获得适用于药物处理的球体。结果显示，不同细胞系三维生长行为差异显著。MKN45形成体积较大、结构较松散的聚集体，外围细胞结合疏松，易于解离；N87则形成致密、边缘平滑、尺寸较小且增长有限的球体。HCT116表现为持续增长的致密球体，HT29则先压实后增长，也能形成较为紧密的球体。该结果表明，不同来源胃肠道肿瘤细胞在三维结构组织性与致密性方面存在明显异质性，这为后续药物敏感性差异提供了模型基础。

Characterization of spheroids by confocal microscopy
在模型建立后，研究人员进一步关注球体内部是否具备适于药物评价的活细胞与微环境特征。通过KI67与HIF-1α免疫荧光染色发现，N87、HCT116与HT29球体在96 h和192 h时均可见广泛增殖细胞，提示这些模型在实验条件下具有良好活性。HIF-1α染色未见明确、广泛的缺氧信号，说明未处理球体整体未形成显著缺氧核心。MKN45由于结构松散，在包埋和切片过程中难以成功制样。该部分结果说明，除MKN45切片技术受限外，其余模型具备开展三维药效学评价的可行性。

Cytotoxicity of single drugs as well as combined drugs in spheroid cell culture
在单药细胞毒性评价中，各药物在不同MCTSs中的IC₅₀跨度极大，呈现显著模型依赖性。总体上，MKN45与HCT116属于相对化疗敏感模型，而N87与HT29则较耐药。以奥沙利铂为例，其在MKN45中的活性远高于N87；5-FU与顺铂也表现出相似趋势。SN38在HCT116中活性最强，而在HT29中基本不活跃。BOLD-100本身则主要表现为中高微摩尔范围活性。联合用药方面，研究人员首先采用与BOLD-100等摩尔比联用，再采用基于各自IC₅₀的近等效比例联用。结果表明，在N87与HCT116中，等摩尔联合总体较单药活性增强；MKN45中联合效应则呈药物依赖性，部分组合活性与单药相当或更低；HT29中无明显细胞毒效应。近等效比例联用在MKN45与HCT116中常获得与单药相当或更优的效应。该部分说明，BOLD-100联合标准化疗药在不同胃肠道三维模型中可增强细胞毒作用，但效果具有显著细胞系特异性。

Evaluation of combination effects
研究人员进一步以Chou-Talalay方法计算组合指数（CI）评估协同或拮抗。由于N87和HT29中多种药物活性不足，CI主要在MKN45与HCT116中可判定。结果显示，在MKN45中，BOLD-100与两种铂类药物联用在一定效应范围内呈轻度协同，但较高剂量时转为拮抗；5-FU与BOLD-100在等摩尔条件下整体表现为轻度拮抗。然而，当5-FU与BOLD-100按IC₅₀相关比例配置时，可转为轻度协同，提示给药比例对联合效应具有重要影响。在HCT116中，所有联合方案在中等效应范围内均表现出不同程度协同，而在较低或较高效应水平上则倾向拮抗。研究人员据此认为，BOLD-100在特定剂量范围内与多种标准药物存在部分协同潜力。

Morphology and growth properties of treated spheroids
为了从形态学层面观察药物作用，研究人员比较了单药和联合处理后球体的体积与外观变化。结果显示，几乎所有联合方案在至少一种测试浓度下均可导致球体显著缩小。单药处理总体影响较弱，联合处理通常引起更明显的生长抑制或结构改变。但值得注意的是，高浓度处理并不总是使球体直径进一步减小，部分情况下反而因球体外周细胞连接松散而表现为直径增大。HCT116对所有联合方案均显示出较符合预期的生长抑制，MKN45与HT29则更易出现结构松散和轮廓不规则。该部分结果表明，联合用药不仅影响细胞活力，也影响三维组织完整性。

Formation of reactive oxygen species in a short-term approach
考虑到BOLD-100含有可发生氧化还原转化的Ru(III)中心，研究人员检测了短时处理后ROS变化。DCFH-DA检测显示，在2 h内，多数等摩尔联合处理随时间和浓度增加可使ROS信号上升，但解释需谨慎。相对变化分析提示，在胃癌球体中，除5-FU外，多数单药及高浓度联合组可诱导ROS升高；在结直肠球体中，奥沙利铂单药及其与BOLD-100联用最稳定地表现出ROS增强。若采用绝对荧光变化解释，则仅高浓度奥沙利铂在全部模型中均明显高于对照，而BOLD-100及5-FU单药并未稳定显示类似现象。研究人员同时指出，BOLD-100固有颜色及检测体系因素可能干扰荧光读数，因此该实验更支持“奥沙利铂是ROS诱导最明显的药物，而其与BOLD-100联用在联合方案中最可能提升ROS”这一相对保守结论。

Induction of apoptosis and necrosis in MCTSs upon treatment with single drugs and combinations with BOLD-100
在细胞死亡方式方面，annexin V/PI流式分析证实，单药和联合处理均可在4种MCTSs中诱导凋亡，并总体呈浓度依赖性。HCT116与MKN45等较敏感模型中，联合方案可诱导较高比例凋亡细胞；例如BOLD-100联合奥沙利铂、5-FU或顺铂在相应模型中均产生明显凋亡。HT29与N87虽整体较耐药，但联合处理同样可诱导一定程度凋亡。值得注意的是，联合处理并未显示出明显加重坏死的趋势，这对于联合治疗安全性评价具有积极意义。此外，较耐药细胞系N87和HT29中坏死细胞比例总体高于敏感细胞系MKN45和HCT116，提示不同模型对治疗的死亡应答模式并不相同。

Discussion
讨论部分强调，MCTSs作为较二维单层培养更接近体内肿瘤结构的三维模型，为联合药物筛选提供了更具转化意义的平台。本研究首次在胃肠道MCTSs中系统考察了BOLD-100与标准化疗药物的联合效应。结果提示，不同细胞系之间存在显著的药物敏感性异质性，这种差异可能与球体形态、细胞间黏附以及糖萼或膜糖蛋白相关特征有关，但本文未作机制层面的直接验证。对于ROS结果，研究人员指出检测体系可能受培养条件与药物本身颜色干扰，因此对BOLD-100氧化应激效应的判断应保持审慎。相比之下，细胞毒性、协同指数以及凋亡分析共同支持BOLD-100与既有药物联用具有一定增敏潜力，且未见明确拮抗性坏死增加。整体上，研究结果与BOLD-100进入临床联合治疗评估的方向相一致。

研究结论翻译如下：
抗癌药物筛选主要通过基于单层培养的细胞培养方法进行。然而，本研究聚焦于三维多细胞肿瘤球体模型，用于评估钌基前药BOLD-100与临床常用细胞抑制药物在胃肠道肿瘤细胞系中联合应用时，对关键细胞过程所产生的影响。结果显示，BOLD-100能够在胃癌和结肠癌模型中与已确立的化疗药物产生协同作用，从而再次验证了其被选用于临床评估的策略。