RNA干扰介导的基因沉默降低欧洲重要媒介昆虫沫蝉（Philaenus spumarius）的存活率并减少其体内木质部限制细菌Xylella fastidiosa的载量

《Journal of Pest Science》：RNAi-mediated gene silencing reduces survival and Xylella fastidiosa load in the insect vector Philaenus spumarius

　　

研究人员针对目前欧洲所有已报道疫情中最重要的流行病学相关媒介——半翅目尖胸沫蝉科昆虫沫蝉（Philaenus spumarius），开展了RNA干扰（RNAi）防控研究。该媒介专一性传播木质部限制细菌（Xylella fastidiosa），现有媒介控制策略在降低病原传播方面效果不稳定，亟需可持续替代工具。RNAi是一种转录后基因沉默机制，可通过外源递送双链RNA（dsRNA）分子触发靶生物特异性基因沉默，已在农业害虫防治中展现出高效性。研究人员首先通过微注射dsRNA靶向6个候选必需基因，评估成虫存活率与转录本丰度变化；随后选择质子ATP酶（ATPase）与瞬时受体电位粘脂蛋白3样异构体X1（TRPML）开展传播功能验证，测定病原获取率、接种效率及虫体内细菌载量。结果显示，靶向ATPase的dsRNA处理组死亡率最高，注射后5天与10天分别达83%与96%。在传播实验中，虽然沉默ATPase未改变媒介传播率，但显著降低了虫体内细菌种群规模，推测其机制可能与介体前肠摄食及流体动力学改变有关，进而影响病原菌定植生长。尽管向吸汁类昆虫递送dsRNA仍具挑战性，该研究证实基于RNAi的工具开发可为媒介昆虫及其传播的植物病原防控提供新路径。

本研究发表于《Journal of Pest Science》，聚焦欧洲重大检疫性病原木质部限制细菌（Xylella fastidiosa，简称Xf）的主要传播媒介沫蝉（Philaenus spumarius），针对现有化学防控效果不稳定且生态副作用大的问题，探索RNA干扰（RNAi）技术在媒介防控中的应用潜力。Xf可侵染橄榄、葡萄等多种经济作物，引发毁灭性病害，目前尚无有效治疗手段，主要依赖铲除病株与广谱杀虫剂压低媒介种群，但常伴随非靶标生物杀伤与抗药性问题。半翅目昆虫特有的持续型非循回传播模式使病原菌仅定殖于介体前肠形成生物膜，传统防控难以阻断传播。RNAi技术凭借序列特异性高、环境降解快的优势，为精准靶向媒介必需基因提供了新思路。

研究人员在意大利皮埃蒙特大区与普利亚大区采集野外种群，分别建立无特定病原实验室饲养体系。通过生物信息学筛选获得6个候选靶基因，设计合成对应dsRNA分子，经体外转录与纯化后采用显微注射法开展功能验证。选取表达下调显著且表型稳定的ATPase与TRPML基因，在普利亚疫区开展媒介传播能力测定，结合实时荧光定量PCR检测虫体与寄主植物的病原载量变化。

筛选候选靶基因

研究人员对6个候选基因开展dsRNA显微注射，监测0至15天存活动态并定量靶基因转录水平。结果显示质子ATP酶（ATPase）与己糖激酶（HEXO）处理组存活率显著低于对照组，其中ATPase注射后5天存活率仅17%，10天降至4%；同期HEXO组分别为20%与8%。所有dsRNA均实现靶基因有效沉默，ATPase转录水平平均下降22倍，26S蛋白酶体、HEXO与TRPML下降幅度达10至17倍。基于高致死率与稳定沉默效果，选定ATPase与TRPML开展传播实验。

传播实验

在疫区田间网室开展三批次重复试验，共注射处理330头成虫。生存分析显示ATPase沉默组死亡率显著高于对照组，TRPML组与对照组无显著差异。qPCR证实两组靶基因均持续高效沉默。病原检测发现，dsRNA处理未显著改变Xf获取率，但ATPase沉默组虫体前肠细菌载量（2.64×10³CFU/头）较对照组（2.15×10⁴CFU/头）降低近9倍，差异达显著水平。接种实验显示，虽未达统计学显著性，但dsATPase组对长春花（Catharanthus roseus）的传播率（7%）低于dsTRPML组（17%）与对照组（33%），呈现下降趋势。

讨论

研究人员指出，V-ATP酶作为质子泵维持细胞器pH稳态与膜运输功能，其H亚基沉默导致复合体失活，可能是ATPase处理组高致死率的核心原因。前肠细菌载量显著降低的机制，可能与V-ATP酶功能受损干扰前肠流体动力学及生物膜定植环境有关。TRPML作为离子通道参与昆虫运动与感知，其沉默可能通过改变摄食行为间接影响病原载量。该研究首次证实靶向沫蝉必需基因的RNAi策略可在不阻断单次传播的前提下，通过降低媒介存活率与体内病原载量，从群体层面削弱传播风险。研究结果为开发针对吸汁式害虫的RNAi制剂提供了关键候选靶点，也为Xf等难防病原的绿色防控开辟了新途径。需注意田间应用仍需解决dsRNA递送稳定性与非靶标安全性评估等问题。