《Journal of Pest Science》：Association of Beauveria bassiana with maize alters volatile organic compounds and enhances attraction of the egg parasitoid Telenomus podisi
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虫生真菌可与植物建立共生关系并影响植物防御机制，促进植物生长并调节作物、植食性昆虫与天敌之间的相互作用。该研究评估了白僵菌（Beauveria bassiana，简称Bb）定殖玉米植株对植物直接防御和间接防御的影响。具体而言，研究人员评估了：（i）种子接种、叶
虫生真菌可与植物建立共生关系并影响植物防御机制，促进植物生长并调节作物、植食性昆虫与天敌之间的相互作用。该研究评估了白僵菌（Beauveria bassiana，简称Bb）定殖玉米植株对植物直接防御和间接防御的影响。具体而言，研究人员评估了：（i）种子接种、叶片接种及未接种Bb的玉米植株上棕翅蝽（Diceraeus melacanthus）的生存与生殖生物学特性，（ii）真菌接种对玉米挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs）排放的影响，以及（iii）玉米挥发物对卵寄生蜂Telenomus podisi搜寻行为的后续影响。真菌定殖经确认在超过75%的叶片处理植株中成功建立。真菌处理植株（叶片喷施或种子处理）对D. melacanthus的生存率以及雌虫繁殖力和育性均无显著影响。Y型嗅觉仪行为测定显示，接种后24小时，T. podisi雌虫对真菌处理植株与未处理植株或清洁空气之间无显著偏好。然而，接种后120小时，寄生蜂显著趋向于叶片接种植株，而非未处理植株或清洁空气对照。在该时间点，叶片接种植株较其他处理排放了更高水平的水杨酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）和更低水平的(E)-β-法尼烯（(E)-β-farnesene）及(E,E)-α-法尼烯（(E,E)-α-farnesene）。这些结果表明，与Bb的共生关系可改变玉米挥发性信号并增强关键卵寄生蜂的趋向性。这种真菌介导的植物间接防御调控可能有助于在害虫综合治理（Integrated Pest Management，IPM）方案中实现虫生真菌与天敌的兼容性。
植物与多种微生物维持共生关系，其中真菌和细菌是主要类群。在这些共生关系中，植物提供栖息地和资源，而微生物则通过促进养分获取、吸收和转化促进植物生长的化合物，以及产生有助于植物抵御生物胁迫的次生代谢物来直接造福植物。由微生物产生或植物在微生物存在下产生的代谢物可以是挥发性或非挥发性的，从而介导植物的直接和间接防御。多项研究表明，真菌和细菌均可改变植物挥发性排放，进而影响植物与昆虫的相互作用。多数研究表明，内生微生物通过驱避植食性昆虫或减少其取食活动来增强植物防御，或通过吸引植食性昆虫的天敌和传粉者来发挥作用。例如，用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）处理的番茄植株产生更多花朵并排放更高水平的挥发性有机化合物，比未处理植株吸引更多传粉者。近期研究还显示，接种有益真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株T22的辣椒植株可影响卵寄生蜂Trissolcus basalis的嗅觉行为。某些微生物与植物的相互作用可能导致挥发性有机化合物的差异产生，从而也可能吸引植食性昆虫。例如，有证据表明内生真菌可能与松柏烯醇（conophthorin）的生物合成相关，该化合物可吸引咖啡果小蠹和脐橙螟等害虫。除与宿主植物协同进化的内生菌外，其他并非天生内生性的微生物也能定殖植物内部组织并表现为内生菌特性。多种虫生真菌已被证实可穿透植物组织并建立内生定殖关系，从而增强植物防御机制。诱导的植物防御可以是直接的，即通过产生对植食性昆虫有毒负效应的次生代谢物。例如，虫生真菌的内生菌株通过定殖植物组织影响多种刺吸式昆虫的生存和取食行为。这些真菌也可与其他内生真菌竞争，可能产生代谢物影响植物与植食性昆虫及第三营养级的相互作用。
植物防御也可以间接方式发挥作用，因为真菌定殖可以修改植食性昆虫诱导的植物挥发物（Herbivore-Induced Plant Volatiles，HIPVs），从而通过增强或干扰天敌的吸引力来改变三级营养关系。在巴西，玉米作物面临多种植食性昆虫的胁迫，其中包括棕翅蝽（D. melacanthus），该虫取食玉米幼苗和早期生长阶段，可导致产量损失高达30%。其侵害在免耕系统下尤为严重，该系统通常先种植大豆后种植玉米。这种大豆-玉米生产系统使蝽类种群全年持续存在，为蝽类提供食物和庇护所，并促进其在玉米脆弱的营养生长阶段早期定殖。D. melacanthus在这些阶段的取食损害可导致植株矮化、出苗减少和随之而来的产量损失，对害虫综合治理方案构成日益严峻的挑战。控制新热带区蝽类的两种有前景的害虫综合治理方法包括利用天敌（如卵寄生蜂）和虫生真菌（如白僵菌和绿僵菌）。Scelionidae科的卵寄生蜂是大豆种植系统中蝽类的关键天敌。据报道，Telenomus podisi在田间条件下可寄生50-70%的蝽类卵。T. podisi通常是大豆田中最丰富的卵寄生蜂物种，被认为是一种广寄生性天敌，可寄生包括D. melacanthus在内的多种蝽类卵。卵寄生蜂通过化学线索组合来定位寄主。在长距离上，它们主要依赖与植食性昆虫存在相关的植物来源信息素。大豆、水稻和玉米植株释放的植食性昆虫诱导的植物挥发物已知可吸引T. podisi。尽管内生虫生病原体日益受到关注，但真菌定殖玉米是否能同时影响D. melacanthus的表现并调控植物间接防御而不损害有益昆虫的活动仍不清楚。因此，该研究旨在评估虫生真菌Bb是否能够定殖玉米植株并影响：（i）D. melacanthus的生存和生殖表现，以及（ii）植物挥发物的排放及其对卵寄生蜂T. podisi觅食行为的后续影响。
该研究选取了Sintetico Spodoptera（SS）基因型的玉米种子，来源于巴西塞蒂拉瓜斯市巴西农牧研究院玉米和高粱种质资源库。种子经表面消毒后萌发，移植至装有天然红壤与有机基质混合物的盆中，在温室自然条件下生长至三叶期（约15天，V3营养生长期）用于实验。D. melacanthus来自巴西利亚巴西农牧研究院遗传资源和生物技术研究所附近大豆田采集的成虫建立的实验室种群，以大豆、向日葵种子、生花生、新鲜四季豆和水为饲料。T. podisi来自同一地点大豆田采集的寄生卵建立的实验室种群，以Euschistus heros的卵为寄主进行饲养。两项实验均在环境室中完成，温度为25±2℃，相对湿度65±10%，光周期14L:10D。
研究人员首先从10株Bb菌株中筛选出对D. melacanthus成虫致病力最强的菌株CG1105用于后续实验。随后，研究了该菌株通过种子处理和叶片喷施两种方式定殖玉米的能力，并设置了接种后是否遭受D. melacanthus取食的组合处理。具体而言，叶片接种组在真菌施用后24小时暴露于蝽类取食（FFHerb）或保持无伤（FF），种子接种组在接种后15天暴露于蝽类取食（SFHerb）或保持无伤（SF），同时设有未接种对照组及单纯蝽类取食组（Herb）。挥发物收集从昆虫放置时开始，每24小时为一个时段，连续进行5天（0-24小时、24-48小时、48-72小时、72-96小时和96-120小时）。挥发物收集使用含有HayeSep Q吸附剂的捕集管，以正己烷洗脱，并加入内标十六内酯进行定量。挥发物收集结束后，通过组织培养法评估真菌的内生定殖情况。同时，研究人员评估了Bb定殖对D. melacanthus生存、雌虫繁殖力（产卵量）和育性（若虫孵化率）的影响，实验周期为35天。此外，利用Y型嗅觉仪在48小时和120小时（叶片接种）或18天（种子接种）检测了T. podisi雌虫对不同处理植株挥发物的行为反应。挥发物成分通过气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）进行定量分析，部分样品通过气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行定性鉴定，化合物通过与标准谱库比对保留指数和质谱图进行鉴定。
在菌株筛选实验中，CG1105和CG1109表现出最高的致死率，其中CG1105因具有更高比例的虫尸僵化率而被选为后续实验菌株。内生定殖结果显示，CG1105菌株可成功内生定殖玉米植株：叶片接种植株中77.8-88.9%检测到真菌定殖，种子接种植株中55.6-83.3%检测到定殖；叶片接种并遭受蝽类取食的植株定殖比例显著高于未取食或种子接种植株，但单个植株片段的真菌检出率仍低于20%。未处理对照植株中未检测到天然存在的Bb内生菌。
挥发物分析方面，叶片接种处理中，研究者选取了12种持续排放的化合物进行时间动态分析。主成分分析（PCA）显示，在首个收集时段（0-24小时），各处理间无明确分离，但随时间推移分离逐渐明显。取食处理（Herb和FFHerb）从第一个时段起即与其他处理区分开来。单项化合物分析显示，(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（DMNT，(E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene）在所有五个时段均表现出处理间显著差异，环桉叶烯（cyclosativene）从第二时段起显示显著变异，这两种化合物主要因蝽类取食而增加。(E)-β-法尼烯在24-48小时FF和FFHerb植株中显著高于对照，(E,E)-α-法尼烯在72-96小时FF和FFHerb植株中高于取食植株。值得关注的是，水杨酸甲酯在72-96小时FF植株中显著高于取食植株。种子接种处理中，PCA模式与叶片接种类似，取食处理始终与其他处理区分，但各化合物处理间差异出现的时间点较不一致。
D. melacanthus的生存和生殖表现结果显示，无论是叶片接种还是种子接种，Bb定殖均未显著影响雄虫和雌虫的生存率，也未对雌虫繁殖力和卵育性产生显著影响。
行为测定结果显示，叶片接种处理在48小时时，T. podisi对FF植株与清洁空气、对照植株之间无偏好，但显著偏好Herb植株而非FF植株；FFHerb植株则显著吸引寄生蜂，优于清洁空气和对照植株。到120小时时，FF和FFHerb植株均显著吸引寄生蜂，优于清洁空气和对照植株；寄生蜂在FF与Herb植株间、FFHerb与FF或Herb植株间无显著偏好。种子接种处理在18天时，SF植株与清洁空气或对照相比无显著差异，但寄生蜂偏好Herb植株而非SF植株；SFHerb植株显著优于清洁空气和对照植株。
讨论部分中，研究人员指出，植物与微生物的共生关系可导致植物防御表型的改变，影响植物与植食性昆虫、天敌和传粉者的相互作用。该研究中，Bb菌株CG1105通过种子或叶片应用成功内生定殖玉米植株，但组织水平的定殖率相对有限，表明真菌在植株内呈异质性分布。这种部分定殖可能解释了为何未观察到对D. melacanthus的直接效应，却仍允许植物挥发性排放和寄生蜂行为发生可检测的变化。内生定殖是一个动态的、时间依赖的过程，涉及真菌穿透、增殖及与植物生理途径的相互作用；因此，即使低水平的定殖也可能足以调节植物信号传导，特别是挥发性介导的间接防御。
研究未发现此前真菌接种对后续蝽类取食产生防御 priming（priming，即先期暴露于某一刺激使植物对后续生物胁迫响应更迅速和/或更强的生理状态）的证据。这一缺失可能与种子处理的真菌剂量有关，而叶片处理中植物已表现出间接防御的诱导。尽管微生物与植物关联的效应常有报道，但这些效应似乎高度可变，强烈依赖于特定的植物-微生物-植食性昆虫系统。
该研究中，叶片接种植株在真菌接种后72-96小时表现出独特的水杨酸甲酯、(E,E)-α-法尼烯和(E)-β-法尼烯排放模式。水杨酸甲酯和(E,E)-α-法尼烯此前已被证实对T. podisi的吸引具有重要作用。研究结果进一步支持水杨酸甲酯作为植食性昆虫诱导的植物挥发物混合物中吸引天敌的关键组分。近期的荟萃分析也证实了其在寄生蜂行为中的一致作用，同时对植食性昆虫通常呈中性效应。因此，FF植株中这些化合物较高水平的排放可能解释了Y型嗅觉仪中T. podisi雌虫对该气味源的偏好。此外，寄生蜂不能区分Herb和FF植株的挥发物，表明两种混合物对天敌均具有吸引性。寄生蜂在首个24小时时段对挥发物的无反应表明，真菌对植物挥发物排放的影响随时间发展，真菌定殖和/或相关植物代谢反应在此阶段尚未完全建立。这种时间模式表明，挥发物排放的调控可能依赖于真菌在植物组织中定殖后的生理变化。水杨酸甲酯排放增加的机制尚不清楚，一种可能的解释是真菌定殖影响了植物防御信号通路的激活。水杨酸甲酯通常与水杨酸信号通路相关，该通路常在植物响应微生物定殖时被激活。然而，尚不确定水杨酸甲酯增加是否直接源于真菌代谢，还是由真菌关联诱导的植物生物合成。玉米植株已知可产生水杨酸甲酯作为其挥发性防御反应的一部分。此外，该化合物排放增加仅在特定时段检测到，这种模式与植物防御基因的瞬时激活一致，表明该增加更可能与真菌定殖触发的植物介导的代谢变化有关，而非该化合物的直接真菌产生。
虫生真菌对植物防御的影响似乎因真菌菌株、宿主植物种类和接种方法而异。该研究中，叶片处理后五天观察到较高的内生定殖水平，这一时期足以让真菌穿透和定殖内部叶片组织。蝽类取食可能通过取食损伤促进真菌进入植物组织。相比之下，种子处理中应用的孢子未与叶片组织直接接触，16天后定殖水平相对较低，主要涉及寄生蜂行为的挥发性化合物在各处理间 largely similar，表明较低程度的内生定殖可能限制了真菌接种对植物挥发性信号及相关三级营养关系的影响。
使用虫生真菌进行害虫管理时需考虑其对天敌的潜在影响。虫生真菌与天敌的联合使用已被提出作为生物防治的兼容策略。多项研究表明，真菌制剂通常对卵寄生蜂影响甚微或无负面影响。此外，大多数农业实践中的真菌应用并非专门针对昆虫卵，进一步降低了卵寄生蜂受到不利影响的可能性。先前研究还报道多种寄生蜂对虫生真菌表现出高度耐受性，特别是当暴露通过环境间接发生而非直接接触真菌孢子时。从应用角度看，农业系统中使用虫生真菌可能提供双重效益，既作为直接防治害虫的生物防治剂，又通过增加天敌吸引力作为间接增强生物防治的手段。高浓度的感染繁殖体通常需要对多种蝽科物种诱导满意的死亡率，而登记的菌剂推荐浓度通常比实验室测定浓度低50-100倍。尽管以较低剂量喷施虫生真菌后蝽类种群降低在田间不一致，但该做法已纳入巴西的害虫管理方案。研究结果提示，真菌与植物的相互作用可能通过增强植物间接防御而非直接提高昆虫死亡率来促成这种防控效果。这种植物-真菌相互作用可能以超出真菌直接致病效应的方式促进害虫抑制。更广泛而言，这些发现凸显了微生物共生体在塑造植物介导的多营养级相互作用中的潜在作用，为将微生物生物防治剂整合入可持续害虫管理策略提供了新视角。
