利用SNP和SSR分子标记对杏（Prunus armeniaca L.）果皮颜色进行遗传解析

《Molecular Breeding》：Genetic dissection of apricot fruit skin color (Prunus armeniaca L.) using SNP and SSR molecular markers

　　

果皮颜色是杏的重要品质性状，显著影响消费者偏好和市场价值。然而，该性状的表型评价耗时较长，并且高度依赖环境条件和采收时间。本研究旨在开发与杏果皮颜色相关的可靠分子标记，以支持育种计划中的标记辅助选择。研究人员对位于3号染色体上的一个主效果皮颜色数量性状位点（QTL）进行了深入解析，进而鉴定到一个参与类胡萝卜素调控的、含AP2/ERF结构域的基因。在该基因内部，同时鉴定了单核苷酸多态性（SNP）和简单序列重复（SSR）多态性。高分辨率熔解（HRM）分析在分离群体‘Goldrich’בCurrot’及57份杏栽培品种材料中验证了一个与果皮颜色高度显著相关的SNP。基于HRM的SNP标记能够准确区分橙色果皮与黄色果皮，在分离群体中的效率达到100%，在品种集合中的效率达到89.5%。与此同时，在AP2/ERF基因内开发的SSR标记揭示了与果皮颜色相关的等位变异，其中一个SSR标记的效率达到93.9%。等位基因及蛋白质序列重建表明，多聚丙氨酸区段长度的变化以及非同义氨基酸替换共同产生了AP2/ERF蛋白的功能多样性。值得注意的是，该分析提示，基于SNP4（S3_22924316）的标记由于可直接影响蛋白质序列，可能具有更强的判别能力，其表现可与此前基于SSR的标记相当。总体而言，这些结果不仅为杏颜色调控提供了机制层面的认识，也为高效育种提供了实用的分子工具。

该文发表于《Molecular Breeding》，围绕杏果皮颜色这一重要商品品质性状展开系统研究，核心目标是从遗传层面解析黄色与橙色果皮差异的分子基础，并开发可直接用于育种实践的高效分子标记。杏果皮颜色直接影响果实外观、消费者接受度及市场价值，也是现代杏育种中兼顾商品性与风味品质时必须重点关注的性状。传统表型鉴定虽然直观，但易受环境条件、成熟度和采收时期影响，尤其对于处于颜色过渡带的材料，表型判定存在不稳定性。这种局限使得仅凭田间观察难以在幼苗阶段开展早期筛选，降低了育种效率。因此，构建与果皮颜色紧密连锁、且具有高判别力的分子标记，是实现杏果皮颜色标记辅助选择的重要基础。

研究背景方面，已有研究表明杏果皮颜色与类胡萝卜素积累密切相关，且在遗传定位上，3号染色体远端区域存在主效果皮颜色QTL。本研究即是在这一基础上，进一步对该QTL区段进行候选基因挖掘和标记开发。研究人员将注意力集中于一个位于该QTL区间内、编码含AP2/ERF结构域蛋白的候选基因Prupe.3G263000。AP2/ERF超家族转录因子在植物果实发育、成熟及色素代谢调控中具有重要作用，因此该基因被认为是解释杏果皮颜色差异的关键候选位点。研究最终证明，该基因内部的SNP与SSR多态性均与果皮颜色显著相关，其中HRM检测的SNP标记和基于ABI分型的SSR标记都表现出较高分类效率，显示出较强的应用潜力。更进一步，研究通过等位基因和蛋白变体重建，揭示了多聚丙氨酸长度变化及非同义突变可能共同塑造AP2/ERF蛋白功能差异，从而影响类胡萝卜素调控与果皮着色。这使得本文不仅完成了标记开发，也对杏果皮颜色形成机制提供了分子层面的解释。

就主要技术方法而言，研究人员采用了三个层面的关键技术策略。首先，以西班牙Murcia地区CEBAS-CSIC试验果园的材料为对象，包括‘Goldrich’בCurrot’ F₁分离群体40个基因型和57个商业栽培品种，利用色差仪在CIELAB颜色空间中测定L*、a*、b*及色调角h°，据此进行果皮颜色表型分类。其次，基于先前QTL定位结果，在候选AP2/ERF基因内开发SNP和SSR标记；其中SNP采用高分辨率熔解（HRM）分析进行分型验证，SSR采用荧光引物扩增结合ABI PRISM 3730测序分型。再次，研究整合公开基因组与SRA重测序数据，对AP2/ERF基因进行等位基因重建，并借助蛋白翻译与结构推断分析多态性对编码蛋白的影响，从而将分子标记与潜在功能变异联系起来。

在结果部分，论文首先以“Characterization of SNP—skin color alleles using HRM”为题，说明研究人员围绕LG3远端主效QTL区中的显著SNP开展验证。重点分析的SNP S3_22924169位于候选AP2/ERF基因内部，在‘Goldrich’בCurrot’群体中与果皮颜色呈高度显著关联。HRM分析显示，在分离群体中，C/T基因型稳定对应橙色果皮，而C/C基因型对应黄色果皮；对于极端黄色和极端橙色单株，该标记分类效率达到100%。当标记扩展验证至57个栽培品种时，HRM熔解曲线可清晰区分C/C、C/T和T/T三类基因型，其中T等位碱基与橙色果皮表现出明显关联，C/C则主要对应黄色果皮。尽管在品种集合中的效率已达到89.5%，但由于仍存在少数不一致材料，研究人员进一步寻找更稳健的标记。

在“Characterization of SSR—Skin color alleles using ABI sequencing”部分，研究人员在多个候选基因中开发SSR标记并比较其判别能力。结果显示，位于同一AP2/ERF基因中的Col1标记表现最佳，加权效率达93.9%，非加权效率达96.4%。该标记共检测到108、111、114和120 bp四种等位片段，其中108 bp等位变异主要与黄色果皮相关，而111、114和120 bp则主要与橙色果皮相关。只有‘Bebeco’和‘Helena’等少数材料与预期表型不完全一致，而这些材料的色调角位于过渡范围，提示成熟时期差异可能影响表型判断。相比之下，位于ζ-胡萝卜素脱氢酶、MYB30及MYB21相关转录因子基因内的其他SSR标记效率较低，难以稳定区分颜色类别。这一结果凸显了AP2/ERF基因内SSR标记在杏果皮颜色分子鉴别中的优势。

在“Allelic reconstruction of the AP2/ERF gene”部分，研究人员结合多个公开杏基因组和SRA数据，对该候选基因进行了等位基因重建。分析发现，该基因内部包含一个由AGC三核苷酸重复组成的SSR位点，并存在4个SNP。综合SSR长度和SNP单倍型信息，可定义4种不同等位基因：Allele 1（SSR108）对应C–G–A–A，Allele 2（SSR111）对应C–G–G–G，Allele 3（SSR114）对应T–T–A–G，Allele 4（SSR120）对应C–G–A–G。该结果说明，AP2/ERF位点的遗传变异并非单一SNP所能完全概括，而是由串联重复长度和多个核苷酸替换共同构成复杂的等位变异体系。

在“Protein reconstruction of the AP2/ERF gene”部分，研究人员进一步将不同等位变异翻译为蛋白质序列，以分析其潜在功能后果。结果显示，AGC型SSR直接影响蛋白内部多聚丙氨酸区段长度，不同SSR长度可形成4至8个连续丙氨酸残基，而不改变整体阅读框。4个SNP中仅SNP3和SNP4导致非同义氨基酸替换，分别影响蛋白中第195位和第146位氨基酸；在这两个位点上，G编码组氨酸（H），A编码酪氨酸（Y）。因此，SSR驱动的多聚丙氨酸长度差异与SNP引起的氨基酸替换共同生成了4种不同的AP2/ERF蛋白变体。该结果为解释不同等位基因如何影响蛋白稳定性、构象或转录调控能力提供了分子依据。

在“Characterization of SNP4 as a candidate marker for skin color using HRM”部分，研究人员针对具有明确非同义效应的SNP4（S3_22924316）开发了新的HRM标记。该位点扩增片段为109 bp，HRM曲线可稳定区分G/G、A/G和A/A三类基因型，非加权效率为96.4%，加权效率为93.9%。表型关联显示，A/A基因型对应黄色果皮，而G/G和A/G基因型对应橙色果皮，但不能进一步区分橙色深浅层次。该标记与SSR标记表现出高度一致的基因型—表型对应关系，再次支持AP2/ERF位点是杏果皮颜色的重要遗传决定因子。研究还指出，个别偏差材料仍然是‘Bebeco’和‘Helena’，进一步说明误差更可能源于表型判读而非标记本身失效。

讨论部分主要围绕AP2/ERF基因在类胡萝卜素调控中的作用及所获标记的育种价值展开。论文指出，杏果皮颜色本质上是一个与类胡萝卜素积累及组成相关的复杂性状，而AP2/ERF转录因子在多种蔷薇科（Rosaceae）果树中已被证实参与果实发育、成熟及色素形成调控。本研究在杏3号染色体主效QTL中鉴定到该类基因，并证明其内部SNP和SSR均可高效预测果皮颜色，支持该基因在果皮色泽形成中的关键作用。进一步地，等位基因与蛋白重建分析提出一个较清晰的功能框架：一方面，SSR造成的多聚丙氨酸长度变化可能影响蛋白—蛋白互作、亚细胞定位或转录调控能力；另一方面，SNP4等非同义变异引起组氨酸/酪氨酸替换，可能影响蛋白的信号响应或转录调节特性。论文还指出，果皮颜色与果肉颜色在杏中具有一定相关性，因此这些标记在实践中还可能兼具间接预测果肉颜色的价值。总体来看，本文提供了可直接服务于早期苗期筛选的分子工具，尤其适用于希望在保留黄色亲本优良风味贡献的同时选育橙色果皮后代的育种方案。

研究结论部分可译为：研究结果表明，位于杏3号染色体主效果皮颜色QTL中的AP2/ERF结构域蛋白编码基因，与果皮黄色和橙色分化密切相关。基于该基因开发的SNP和SSR分子标记均表现出较高的分类效率，其中HRM检测的SNP标记在分离群体中达到100%效率，在栽培品种中也表现出很高准确性；AP2/ERF基因内的SSR标记同样具有较强判别能力。等位基因和蛋白变体重建进一步表明，多聚丙氨酸区段长度变异及非同义氨基酸替换共同构成该蛋白的功能多样性。尤其是直接影响蛋白序列的SNP4（S3_22924316），显示出作为更优候选标记的潜力。总体而言，该研究不仅深化了对杏果皮颜色调控机制的认识，也为杏分子育种和标记辅助选择提供了切实可用的工具。