螺旋藻（Spirulina platensis）对聚乙烯纳米塑料（PE-NPs）暴露下克氏原螯虾（Procambarus clarkii）部分生物标志物变化的保护作用

《Hydrobiologia》：The protective role of Spirulina platensis against the alterations in some biomarkers in crayfish (Procambarus clarkii) exposed to polyethylene nanoplastics

　　

本研究旨在阐明螺旋藻（Spirulina platensis, SP）阻碍聚乙烯纳米颗粒（polyethylene nanoparticles, PE-NPs）在克氏原螯虾（Procambarus clarkii）体内积累并减轻其有害影响的潜力。研究设置了四个实验组：对照组（仅投喂饲料）、PE-NPs组（10 mg/L）、PE-NPs（10 mg/L）+螺旋藻组以及仅螺旋藻组。仅暴露于PE-NPs的组别显示：（1）氧化应激酶活性升高，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）和总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）；（2）神经系统和免疫系统酶活性降低，包括一氧化氮（nitric oxide, NO）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AchE）、溶菌酶（lysozyme, LYZ）、酚氧化酶（phenoloxidase, POX）和酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）；（3）作为循环系统标志物的血细胞计数减少。在PE-NPs+螺旋藻处理组中，观察到以下积极效应：（1）氧化应激酶活性降低约9%；（2）神经参数显著增加约10.5%；免疫参数中LYZ和ACP轻微增加约6.5%，而POX酶升高18%直至恢复至正常活性水平；（3）血细胞计数显著增加18%。研究结果阐明了螺旋藻减轻PE-NPs对克氏原螯虾不良影响的能力。

塑料因其强度、柔韧性、低成本和防水性等特性，在全球范围内的生产与应用日益增加，然而在医疗、健康、技术和食品等领域的广泛应用也带来了严峻的环境问题。塑料废弃物的不当管理和持久性导致其在环境中大量累积，对动物生态系统构成严重危害。塑料按来源可分为初级塑料和次级塑料，按尺寸则分为宏塑料、中塑料、微塑料和纳米塑料。纳米塑料（nanoplastics, NPs）粒径范围为1–100 nm，凭借其独特的纳米尺度物理化学性质，能够穿透生物屏障、影响细胞功能并在生物体内生物累积，还可增强持久性有机污染物（persistent organic pollutants, POPs）等环境污染物在聚合物表面的吸附。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）作为一种广泛分布的淡水甲壳动物，因其美味和丰富营养而深受消费者喜爱，在中国已成为最重要的水产养殖物种之一。该物种对环境变化敏感，被广泛应用于环境监测的生物指示物研究。然而，现有研究表明微塑料颗粒不仅造成水体和沉积物污染，还会在克氏原螯虾的鳃、胃、肠道和肌肉等组织中累积。前期研究发现，克氏原螯虾暴露于不同浓度的75 nm聚苯乙烯纳米塑料后，其谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）及蛋白质羰基化水平均随纳米塑料浓度升高而发生显著变化。另有研究揭示纳米塑料对幼体克氏原螯虾存在浓度依赖性效应：低浓度（10 mg/L）激活抗氧化和免疫反应，而较高浓度（20–40 mg/L）则导致免疫抑制、氧化损伤以及代谢和渗透调节功能紊乱。

尽管已有大量文献报道纳米塑料的负面效应，但其修复治理研究仍显不足。微藻作为一种经济有效的藻修复（phycoremediation）方法，因具有成本低、设计简单、适应极端条件、有效去除废水中过量营养盐且无二次污染等优点而备受关注。螺旋藻（Spirulina platensis）是一种具有抗氧化、免疫调节和抗炎等多种生物学活性的微藻，目前已被广泛用于生产营养补充剂。鉴于此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明螺旋藻在去除纳米塑料及减轻其对克氏原螯虾毒性方面的潜在作用。该论文发表在《Hydrobiologia》。

本研究采用的主要关键技术方法包括：实验对象取自埃及阿斯尤特省尼罗河的成年克氏原螯虾（20±5 g），在阿斯尤特大学理学院鱼类生物学与污染实验室进行养殖；将实验动物分为四组进行14天暴露实验；使用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）对PE-NPs进行表征；通过商业化试剂盒检测血淋巴中抗氧化酶（SOD、CAT、GPx、GSH、TAC、MDA）、神经参数（NO、AchE）、免疫参数（LYZ、POX、ACP）及肝功能标志物（AST、ALT、总蛋白）活性；采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析血淋巴生化特征；使用SPSS 20进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验。

研究结果部分呈现如下：

抗氧化生物标志物：通过检测血淋巴中抗氧化酶活性，研究发现PE-NPs组中SOD、GPx、GSH和TAC水平显著升高约13%（P≤0.024），而与螺旋藻联合处理后这些标志物活性降低约9%（P<0.05）。MDA和CAT活性在PE-NPs组呈下降趋势（降低17%），但在PE-NPs+螺旋藻组轻微升高11%。单独螺旋藻组所有抗氧化参数与对照组相似。

神经参数：通过测定NO和AchE活性，研究发现PE-NPs暴露14天后NO和AchE水平下降约17.6%，而PE-NPs+螺旋藻组这些参数活性增加约10.5%（AchE：P≤0.023；NO：P≤0.014）。单独螺旋藻组对上述神经参数无显著影响。

免疫活性：通过检测LYZ、POX和ACP活性，研究显示PE-NPs组这三种酶活性显著降低约18%，而添加螺旋藻后LYZ和ACP活性轻微增加约6.5%，POX则显著增加18%并恢复至正常活性水平（P<0.05）。单独螺旋藻组仅使POX轻微增加2%，对LYZ和ACP无显著影响。

肝功能标志物：通过测定AST、ALT和总蛋白，研究观察到PE-NPs组肝脏酶分泌呈上升趋势（约增加14%），而PE-NPs+螺旋藻组AST、ALT和总蛋白活性降低4%（P<0.05）。

血淋巴测量：通过计数颗粒细胞、半颗粒细胞及总血细胞，研究发现PE-NPs组血细胞总数较对照组低15%，而PE-NPs+螺旋藻组显著增加18%（P≤0.0000）。

FTIR分析：通过检测血淋巴FTIR光谱，研究观察到对照组和单独螺旋藻组在~3295 cm?1（O–H和N–H伸缩振动）、~2915和2870 cm?1（C–H伸缩振动）、~1536 cm?1（酰胺II带）及~1168–1106 cm?1（C–O–C和P=O振动）处呈现特征吸收峰。PE-NPs组出现特征性光谱改变：C–H伸缩振动带强度显著增加，~698 cm?1处出现聚乙烯特征峰，~1700 cm?1处出现羰基化合物C=O伸缩振动峰；同时~3295 cm?1带减弱提示羟基和胺基官能团损失，酰胺II带减弱。PE-NPs+螺旋藻组显示光谱部分恢复：C–H峰相对减弱，酰胺II带强度恢复，O–H/N–H区改善，C=O峰和~698 cm?1带均较PE-NPs组减弱。

讨论部分，研究人员系统阐述了PE-NPs对克氏原螯虾的多系统毒性机制及螺旋藻的保护作用。众多研究已证实纳米塑料对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、斑马鱼（Danio rerio）、克氏原螯虾等水生动物具有毒性效应，主要表现为活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高。ROS是生物代谢的重要副产物，其产生与清除失衡可导致氧化应激、细胞死亡和组织损伤。甲壳动物可通过调控抗氧化酶系统消除ROS并修复受损组织，其中SOD作为抵御ROS的第一道防线，能将超氧阴离子（O??）转化为过氧化氢（H?O?）。本研究中PE-NPs组SOD活性显著升高，与Zhang等人报道的聚乙烯微塑料暴露结果一致，但也存在不同物种间的差异。GPx、TAC和GSH等抗氧化酶同样参与减轻过量ROS的有害效应，本研究中这些酶活性在PE-NPs暴露后升高，而螺旋藻处理后降低，表明螺旋藻可缓解PE-NPs的毒性效应。CAT酶将H?O?转化为H?O，本研究中PE-NPs组CAT活性低于对照组，提示ROS积累可能超出抗氧化系统的清除能力，而螺旋藻可促进CAT酶活性恢复。MDA作为脂质过氧化指标，其变化趋势与前人研究一致。

关于神经参数，NO在多种生物系统中发挥重要作用。本研究中PE-NPs组NO活性下降与Zhang等人结果一致，而螺旋藻处理可提高NO水平。AchE作为重要神经毒性生物标志物，其活性在PE-NPs暴露后受到抑制，螺旋藻处理可使其轻微回升。这与阿根廷沼虾（Palaemonetes argentinus）暴露于聚乙烯微塑料后AchE活性显著降低的结果相似，但与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）暴露于聚苯乙烯微塑料的结果存在差异。

免疫参数方面，PE-NPs组LYZ活性低于对照组，与多种虾蟹类研究结果一致，而螺旋藻处理可显著提升LYZ活性。PE-NPs组POX和ACP活性显著降低，与土耳其螯虾（Astacus leptodactylus）暴露于微塑料的结果相符，螺旋藻处理可提升这两种酶活性。肝功能方面，PE-NPs组AST和ALT活性升高与肝细胞损伤或死亡相关，总蛋白变化趋势与部分研究一致。血细胞计数作为甲壳动物先天免疫的重要指标，在PE-NPs暴露后下降，而螺旋藻处理可使其恢复至正常水平。

FTIR光谱分析为理解纳米塑料的组织损伤机制提供了分子层面的证据。对照组和螺旋藻组的特征吸收峰反映了正常的蛋白质、脂质和碳水化合物结构；PE-NPs组的特征性改变证实了聚乙烯的内化、氧化应激导致的脂质过氧化和蛋白质氧化，以及膜相关磷脂和糖类的破坏；螺旋藻处理组的光谱部分恢复则支持了其保护作用的分子机制。

研究结论部分指出：PE-NPs颗粒可进入克氏原螯虾血淋巴并累积，导致氧化应激、免疫、神经和循环系统多系统严重损伤；而采用螺旋藻进行藻修复是一种可行的生物修复处理手段，能够减轻PE-NPs对克氏原螯虾的毒性效应。因此，研究人员建议螺旋藻补充可作为一种有前景的商业水产养殖策略，提供一种天然且经济有效的方式，在纳米塑料污染等环境挑战下增强养殖物种的健康和抗应激能力。