《Veterinary Research》：Potent neutralization and therapeutic efficacy of bovine rotavirus-specific VHH antibodies in infected calves
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牛轮状病毒（Bovine rotavirus, BRV）是导致1月龄以下犊牛急性腹泻的主要病原之一，对集约化养牛业构成严重威胁。由于BRV常与其他病原混合感染，目前尚无有效的治疗药物。本研究通过免疫双峰驼构建了容量为6.5×108、重组阳性率为81.25%的噬
牛轮状病毒（Bovine rotavirus, BRV）是导致1月龄以下犊牛急性腹泻的主要病原之一，对集约化养牛业构成严重威胁。由于BRV常与其他病原混合感染，目前尚无有效的治疗药物。本研究通过免疫双峰驼构建了容量为6.5×108、重组阳性率为81.25%的噬菌体展示抗体库。以BRV为抗原筛选获得三个高活性重链可变区（variable heavy-chain domain, VHH）。将基因片段连接至原核表达载体pET–22b(+)，并在异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷（isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG）诱导下成功表达重组VHH。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）及细胞免疫荧光实验证实，重组VHH可特异性结合BRV。病毒中和试验进一步验证了VHH的中和活性。在BRV攻毒犊牛模型中，重组VHH能够缓解腹泻和高热症状，并减少病毒排出量。结果表明，本研究筛选获得的抗BRV单域抗体可作为BRV感染的有效治疗手段，有助于新型抗BRV药物的开发。
本研究发表于《Veterinary Research》，针对当前集约化养牛业中犊牛腹泻防控难题，尤其是牛轮状病毒（BRV）缺乏特异性治疗手段的问题展开。BRV是全球范围内导致幼龄犊牛急性腹泻的核心病原，常与其他肠道病原混合感染，造成高发病率和高死亡率，现有疫苗多为多价制剂，依赖母源抗体传递，保护期短且存在抗原干扰现象，因此亟需开发新型治疗策略。研究旨在通过构建BRV特异性单域抗体（single-domain antibodies, sdAbs，又称VHH）库，筛选具有高中和活性的候选抗体，并验证其在体内外的抗病毒效果，为BRV感染的被动免疫治疗提供可行方案。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：以1岁雌性双峰驼为免疫对象，使用BRV NM06毒株进行四次免疫，采集外周血分离单个核细胞（PBMC）提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因并构建噬菌体展示抗体库；利用生物淘选富集BRV特异性噬菌体克隆，经ELISA筛选高亲和力VHH并进行原核表达与纯化；在细胞水平通过间接ELISA、免疫荧光及病毒中和试验评估VHH的结合与中和活性；在体内阶段，选用12头5日龄雄性荷斯坦犊牛，随机分为BRV攻毒组、抗体治疗组和PBS对照组，口服攻毒后连续6天静脉注射VHH clone 73（剂量1 mg/kg，每日两次），监测临床症状、直肠温度和粪便评分，并通过RT-qPCR定量粪便病毒载量，结合小肠组织H&E染色评估病理变化。
研究结果如下：
免疫血清滴度与中和活性：第四次免疫后骆驼血清抗体滴度达1:32?000，中和试验显示1:21稀释血清可保护50% MA-104细胞免于BRV致病变效应（cytopathic effect, CPE）。
BRV特异性噬菌体展示库的构建与富集：成功扩增约400 bp全长VHH基因，库容6.5×108，重组阳性率81.25%；三轮生物淘选后BRV特异性噬菌体富集67.97倍，筛选出42个阳性克隆，其中clone 7、73、93结合活性最高。
BRV特异性sdAb的表达与纯化：在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达，蛋白分子量约20 kDa，经Ni–NTA树脂纯化后纯度较高。
BRV特异性sdAb的体外功能活性：ELISA结果显示三株VHH均呈浓度依赖性结合BRV，最低有效浓度为625 ng/mL；免疫荧光证实其可在感染细胞中特异性识别BRV；中和试验中，clone 7、73、93分别在≥40 μg/mL、≥20 μg/mL、≥20 μg/mL浓度下可中和≥50%病毒感染。
犊牛攻毒模型中的保护效果：抗体治疗组体温升高幅度低于攻毒组，仅出现短暂软便，第4天粪便恢复正常；病毒载量自攻毒后第3天显著低于攻毒组（p<0.01–0.001）；H&E染色显示小肠组织损伤轻微，绒毛结构基本完整。
讨论部分指出，现有BRV疫苗多为灭活或弱毒多价苗，存在安全性与持久性不足的问题，而VHH抗体兼具高亲和力、高稳定性及易规模化生产的优势，为被动免疫提供了新工具。研究结论表明，所获得的抗BRV VHH抗体在体内外均表现出强效中和活性，能显著减轻感染犊牛的临床症状、降低病毒排出并保护肠道组织，具备作为BRV特异性治疗制剂的应用潜力。未来需进一步明确其分子中和机制、评估对不同BRV基因型的交叉保护效果，并扩大动物试验样本量以提升证据强度。
