《Molecular and Cellular Pediatrics》：Preventive application of lung growth factors and lack of attenuation of phenotype disruption of lung resident MSC from preterm infants by hyperoxia
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背景：肺常驻间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）的表型破坏是支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia, BPD）发病过程中的一个关键事件。高氧（Hyperoxia, HOX）是导致生长停滞和功能特
背景：肺常驻间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）的表型破坏是支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia, BPD）发病过程中的一个关键事件。高氧（Hyperoxia, HOX）是导致生长停滞和功能特性改变（包括血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）下调）的主要有害因素之一。成纤维细胞生长因子-10（Fibroblast Growth Factor-10, FGF-10）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF）、胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1）和血小板衍生生长因子-AA（Platelet-Derived Growth Factor-AA, PDGF-AA）被认为是维持肺生长的有前景的细胞因子。研究人员研究了这些因子在MSC培养物暴露于高氧前的预防性应用。
结果：正如之前所述，高氧抑制了MSC的自发增殖并诱导了细胞死亡。在HOX80%条件下的生长抑制比在HOX40%条件下更显著。无论是在较温和的HOX40%暴露期间，单次预防性应用治疗剂量的FGF-10、HGF、IGF-1或PDGF-AA，还是在高氧（40%或80%）期间重复应用，均不能减弱高氧引起的生长抑制和细胞死亡诱导。此外，以PDGFRα下调为关键标志事件的表型破坏仍未改变。
结论：研究人员的数据表明，高氧对肺常驻MSC的有害影响非常显著，以至于单一的肺生长促进细胞因子无法减弱其引起的表型破坏、生长抑制和细胞死亡。该结果要求在研究旨在预防BPD的肺生长促进因子及其他治疗药物的治疗潜力时，应重点关注MSC的功能。
论文解读：肺生长因子预防性应用对高氧诱导的早产儿肺常驻MSC表型破坏的影响
研究背景与目的
支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia, BPD）是早产儿，尤其是极早产儿常见的慢性肺部疾病，其病理特征为出生后肺进一步发育受阻，主要表现为肺泡和微血管的简化。目前研究表明，肺常驻间充质干细胞（lung resident Mesenchymal Stem Cells, MSC）的表型破坏是BPD发病机制中的关键事件。早产儿出生后常需接受高氧（Hyperoxia, HOX）治疗及机械通气（Mechanical Ventilation, MV），其中高氧是构成肺损伤的主要有害因素之一，可导致肺驻留MSC的生长停滞、细胞死亡以及功能特性改变，典型特征为血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）的下调。基于既往病理机制理解，肺生长促进因子如成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）被认为是有前景的、可维持肺发育的细胞治疗候选物。然而，这些单一细胞因子在直接作用于受高氧损伤的早产儿肺常驻MSC时能否发挥保护或预防作用，此前尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在探讨在MSC培养物暴露于高氧前预防性应用上述四种肺生长促进细胞因子，是否能减弱高氧导致的生长抑制、细胞死亡及表型破坏（特别是PDGFRα的下调）。该研究发表于《Molecular and Cellular Pediatrics》。
主要关键技术方法
研究人员从胎龄小于30周的早产儿气管吸出物中建立肺常驻MSC细胞培养模型（n=4例临床样本），细胞纯度经流式细胞术鉴定（CD73+、CD90+、CD45-）。实验设置包括常氧（Normoxia, NOX）对照组，以及40%高氧（HOX40%）和80%高氧（HOX80%）暴露组（持续72小时）。预防性干预措施为在高氧暴露前24小时单次或每隔24小时重复添加治疗剂量的重组细胞因子（IGF-1 100 ng/ml、FGF-10 10 ng/ml、HGF 10 ng/ml、PDGF-AA 10 ng/ml，以及FGF-10与PDGF-AA联合预处理）。通过流式细胞术结合细胞计数微球测定活细胞数量以计算细胞扩增指数（Cell Expansion Index, CEI），并通过Annexin V和SYTOX Blue双染法定量细胞死亡；利用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测PDGFRα、α平滑肌肌动蛋白（αSMA）及内参GAPDH的蛋白表达水平。数据统计采用双因素ANOVA及Bonferroni多重比较检验。
研究结果
Preventive application of IFG1, FGF-10, HGF and PDGF-AA and growth inhibition of MSC by HOX（IGF-1、FGF-10、HGF和PDGF-AA的预防性应用及高氧对MSC生长抑制的影响）
研究人员观察到，暴露于HOX40%或HOX80%的早期代次MSC培养物表现出典型的增殖抑制，且在HOX80%下抑制更为显著。无论是单次预防性应用上述四种生长因子中的任何一种，还是在高氧期间每24小时重复添加，均未在活细胞计数及细胞扩增指数（CEI）的测定中显示出可视或可测量的益处，即未能减轻高氧对MSC增殖的抑制作用。
Preventive treatment with IFG1, FGF-10, HGF and PDGF-AA and cell death induction of MSC by HOX（IGF-1、FGF-10、HGF和PDGF-AA的预防性处理及高氧对MSC细胞死亡诱导的影响）
结果显示，HOX40%诱导的细胞死亡率仅轻微增加（<10%），而HOX80%暴露72小时可使细胞死亡率增加至约40%。与此前生长抑制的研究一致，预防性应用这四种细胞因子中的任何一种，均未能显著减少高氧诱导的MSC细胞死亡，且在每日重复添加生长因子的实验中结果依然不变。
Preventive IFG1, FGF-10, HGF and PDGF-AA and changes in MSC marker protein expression by HOX exposure（预防性IGF-1、FGF-10、HGF、PDGF-AA及高氧暴露引起的MSC标记蛋白表达变化）
研究人员此前已确定PDGFRα和αSMA是受高氧或炎症暴露调控最强的MSC标记蛋白。本实验中，HOX80%诱导了比HOX40%更显著的蛋白水平变化，具体表现为两种高氧暴露均降低了PDGFRα的表达，而HOX80%还额外降低了αSMA的表达。预防性应用IGF-1、FGF-10、HGF和PDGF-AA均未能改变高氧介导的PDGFRα和αSMA蛋白水平下调；即使每日向培养物中添加生长因子或采用FGF-10与PDGF-AA联合预处理，该表型破坏依然未被阻止。
Combinatorial pretreatment with FGF-10 and PDGF-AA（FGF-10与PDGF-AA的组合预处理）
最后，研究人员测试了FGF-10与PDGF-AA的组合预防性处理。与单一细胞因子应用的结果一致，无论是单次还是重复组合预处理，均未检测到对HOX40%和HOX80%诱导的生长抑制、细胞死亡诱导及MSC标记蛋白（PDGFRα、αSMA）表达变化的任何改善。
讨论与结论总结
研究人员指出，高氧是出生后暴露中对未成熟肺最具破坏性的损伤因素，临床中早产儿在NICU期间不可避免地暴露于高氧环境。基于啮齿类动物模型中得出的 promising临床前结果，研究人员选取了四种在实验证据中尤其具有吸引力或已进入临床研究阶段（如IGF-1）的候选细胞因子。尽管采用了最具获益可能的预防性应用方式（即在开始高氧暴露前施加），在研究人员使用的体外实验环境中，这些因子未能对来源于早产儿的肺常驻MSC的生长促进能力、存活率及标记蛋白表达产生任何益处；该结果在来自不同性别及不同肺预后婴儿的MSC培养物中均一致。这意味着，对于这四种高度预期的候选因子（IGF-1、FGF-10、HGF和PDGF-AA），其数据甚至未显示出任何有益的趋势。
研究人员模拟了HOX40%（较轻的气体交换紊乱及较低氧浓度）和HOX80%（严重紊乱及较高氧浓度）两种情况。通过研究分离的肺常驻MSC培养物，研究人员明确了高氧对MSC的直接影响，排除了体内肺部炎症免疫反应放大作用的干扰。但也正因如此，该治疗干预未能考察高氧对其他肺细胞类型（如上皮细胞和血管内皮细胞）的影响或对其他细胞产生的间接益处（例如通过调节炎症反应），这可能解释了啮齿类动物研究中可见有益效果而人细胞培养模型未见的原因。不过，研究人员也提到，啮齿类动物与人类在多种干预治疗效力上存在较大差异，本研究数据可能为这一差异列表增添新的候选案例。
研究人员承认本研究存在一些局限性：实验设计用于测试简化实验设定（孤立高氧暴露）下的预定结果，未采用非偏向性方法，也无法还原体内复杂的机械通气等多种暴露场景；此外，由于研究方案所限，实验未能在大量MSC培养物（仅n=4个不同样本，且均伴有中/重度BPD）上开展，可能错过了细微变化。但考虑到此前国内外多个实验室在肺常驻MSC体外研究中，仅需3至8次独立培养物重复即可得出适用于早产儿普遍人群的相关且显著结果，本研究中出现普遍适用的不同结果的可能性较低。研究人员也指出，虽然获得的MSC来自已暴露于促炎刺激（高氧、机械通气及部分感染刺激）的早产儿肺，但几乎所有常驻MSC在出生后都会暴露于某种形式的炎症刺激，因此仅能在有害暴露开始前生效的疗法对大多数早产儿而言并不现实；且研究人员此前已证实，诱导的MSC表型变化原则上是可逆的。
结论翻译：综上所述，研究人员针对最强刺激及未成熟肺毒性暴露——高氧损伤背景下，对单一肺生长促进细胞因子治疗潜力的研究，未能证实其对这一特定细胞群有任何治疗益处。这些结果虽然初看令人失望，但不应阻碍针对其他肺生长促进因子（如VEGFA、EGF或CTGF）的进一步研究，因为损伤暴露后这些细胞因子的变化幅度表明仅替代单一细胞因子是不够的。未来的研究方向应侧重于几种最有前景候选因子的组合，并应包括本研究范围之外的肺其他区室（compartments）。同种异体MSC应用可能是一种有前景的替代方案，其既能分泌大量肺生长促进因子，又能释放具有抗炎作用的细胞因子，从两个不同侧面发挥有益作用。虽然重复应用在本次实验设置中无优势，但其尤为值得期待，因为这可以克服有益因子失活及外源性MSC在炎症肺中功能特性丧失的问题；但局部微环境及机械通气和高氧暴露可能限制其功能。对于任何未来的干预研究（特别是旨在保护或挽救肺生长的靶向干预），必须在各年龄段重视MSC的功能，因为本研究的影响超出新生儿期，这些数据应鼓励面临高氧损伤或组织再生需求的肺研究人员在设计研究时考虑这些发现。
