《Transboundary and Emerging Diseases》：A Triplex Real-Time PCR Assay for Simultaneous Detection of Streptococcus suis, Glaesserella parasuis, and Actinobacillus pleuropneumoniae
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猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）是一种由多种致病因子协同作用引起的猪多因素疾病综合征，其中细菌性病原体起着重要作用。猪链球菌（Streptococcus suis, SS）、副猪格拉瑟菌（
猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）是一种由多种致病因子协同作用引起的猪多因素疾病综合征，其中细菌性病原体起着重要作用。猪链球菌（Streptococcus suis, SS）、副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis, GPS）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是与猪呼吸道疾病相关的重要细菌制剂，凸显了对快速、准确且能同时检测这三种病原体的方法的迫切需求。在本研究中，研究人员开发了一种用于同时检测 SS、GPS 和 APP 的三重实时荧光定量 PCR（triplex real-time PCR）分析法，并评估了该方法在临床健康猪扁桃体样本中的性能。该分析法显示出高特异性、高敏感性和良好的可重复性。研究人员平行使用三重实时荧光定量 PCR 分析法和传统 PCR 分析法对总计 228 份扁桃体样本进行了分析。三重实时荧光定量 PCR 分析法在 91.23%（208/228）的样本中检测到至少一种病原体，这一比例显著高于传统 PCR 分析法检测到的 73.68%（168/228）。通过三重实时荧光定量 PCR 分析法在 98 份样本（42.98%）中观察到多种病原体的并发检测，其中包括 82 份同时呈 SS 和 GPS 阳性的样本（35.96%）以及 16 份 SS、GPS 和 APP 均呈阳性的样本（7.02%）。从三重阳性样本中回收到 12 株 SS 分离株，其中 91.67%（11/12）为多重耐药株。动物攻毒实验进一步证实了两株代表性分离株 SZWUSS183（荚膜多糖 cps 类型 1/2，序列型 ST7）和 SZWUSS225（cps 类型 3，ST117）的毒力。总体而言，所开发的三重实时荧光定量 PCR 分析法为同时检测这些主要细菌病原体提供了一种敏感且可靠的工具，可能有助于监测这些病原体在猪群中的传播和共发生情况。
猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是由多种病原因子协同作用引起的一系列呼吸道疾病，对全球养猪业构成严重威胁并造成巨大经济损失。在引起 PRDC 的细菌病原体中，猪链球菌（SS）、副猪格拉瑟菌（GPS）和胸膜肺炎放线杆菌（APP）最为普遍，且常在猪群中被共同检测到。SS 是一种重要的人畜共患病原体，可引起猪脑膜炎、败血症等全身性疾病，并具有感染人类的潜力，构成重大公共卫生风险。GPS 是格拉瑟氏病（Gl?sser's disease）的病原体，以浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。APP 主要影响断奶仔猪，引起以出血性、纤维蛋白性和坏死性胸膜肺炎为特征的猪传染性胸膜肺炎。目前，针对这三种病原体的诊断方法主要依赖细菌分离和单重 PCR 检测。然而，随着猪生产中混合感染日益普遍，现有的多重 PCR 方法因靶基因物种特异性不足而存在局限。因此，开发一种快速、准确且能同时检测这三种病原体的方法显得尤为必要。
本研究旨在开发一种针对 SS 的 recN 基因、GPS 的 HPS_219690793 基因以及 APP 的 apxⅣ基因的三重实时荧光定量 PCR 分析法（简称三重检测法），以实现对这些主要细菌病原体的快速可靠检测。同时，研究人员对三重阳性样本进行了细菌分离，以进一步表征流行 SS 菌株的抗菌药物耐药性概况和毒力潜力。该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。
为开展此项研究，研究人员采集了来自中国江苏、广东、广西和湖南四个省份屠宰场临床健康猪的 228 份扁桃体样本。关键技术方法包括：设计并优化特异性引物和探针，构建包含目标基因片段的标准质粒以建立标准曲线；通过系列稀释实验确定检测限（LOD），并利用多种非目标细菌验证特异性；计算 Ct 值的变异系数（CV）以评估批内和批间重复性；将新开发的三重检测法与传统 PCR 法平行应用于临床样本检测，并进行统计学比较；对三重阳性样本进行细菌分离培养，利用 Illumina 平台进行基因组测序，通过生物信息学分析确定荚膜多糖（cps）基因型和多位点序列分型（MLST）；采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MICs）以评估耐药性；最后利用斑马鱼和 BALB/c 小鼠感染模型评估分离株的毒力。
研究结果如下：
标准曲线构建：三种病原体的标准曲线线性回归方程的相关系数（R2）均大于 0.99，扩增效率在 90% 至 110% 之间，表明该三重检测系统具有良好的线性关系和扩增效率。
灵敏度分析：该方法对 SS、GPS 和 APP 质粒标准的最低检测限（LOD）均为 1×102 copies/μL。在纯培养物中，LOD 分别为 200 CFU（SS 和 GPS）和 400 CFU（APP）；在复杂的扁桃体组织样本中，三者的 LOD 均为 500 CFU，证明其在复杂基质中仍具高灵敏度。
特异性分析：对六种非目标细菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等）进行测试，未观察到非特异性扩增，仅 SS、GPS 和 APP 呈现特异性信号，证实了该方法的高特异性。
重复性测试：批内和批间重复性实验显示，Ct 值的变异系数（CV）分别在 0.48%-1.58% 和 0.60%-2.03% 之间，表明该方法具有优异的重复性和重现性。
临床样本检测与对比：在 228 份临床样本中，三重检测法检出至少一种病原体的比例为 91.23%，显著高于传统 PCR 的 73.68%。其中，SS 检出率为 89.47%，GPS 为 44.74%，APP 为 7.02%。共检出 98 例混合感染（42.98%），以 SS 和 GPS 双重感染最为常见。部分传统 PCR 阴性但三重检测法阳性的样本成功分离出细菌，进一步验证了新方法的灵敏度。
SS 分离株分型：从 16 份三重阳性样本中分离出 12 株 SS，涵盖 7 种 cps 类型和 12 种不同的序列型（ST）。其中发现两株值得关注的菌株：SZWUSS183（cps 1/2 型，ST7）和 SZWUSS225（cps 3 型，ST117）。
耐药性分析：所有分离株均对红霉素、阿奇霉素和四环素耐药，91.67% 为多重耐药株（对≥3 类抗生素耐药）。基因组分析检测到多种耐药基因，如 tet(O)、erm(B) 和 optrA 等，与表型结果一致。
动物感染实验：斑马鱼和小鼠攻毒实验证实，SZWUSS183 和 SZWUSS225 具有高毒力，其中 SZWUSS183 在小鼠中的致死率高达 80%，与高致病性参考菌株无显著差异。
讨论与结论部分总结指出，本研究开发的三重实时荧光定量 PCR 分析法利用物种特异性基因，克服了以往方法特异性不足的问题，具有高灵敏度、高特异性和良好的重复性，适用于临床混合感染的快速诊断。研究发现临床健康猪群中 SS 和 GPS 的共感染率较高，且分离到的 SS 菌株中多重耐药现象普遍，提示兽医临床抗生素滥用问题严峻。特别值得注意的是，从健康携带者中发现了具有高度毒力的罕见 cps 1/2-ST7 型 SS 菌株，以及广泛流行的 cps 3-ST117 型菌株，这表明健康猪群可能是潜在致病菌系的重要储存库，存在被低估的流行病学风险。综上所述，该研究不仅提供了一种高效的诊断工具，还为猪呼吸道细菌共感染的监测、风险评估及防控策略提供了重要的科学依据。
