来自Pluralibacter gergoviae的一种具有ART折叠结构的Rhs毒素定义了Tne5——一个新的NAD(P)糖水解酶效应蛋白家族

《Journal of Biological Chemistry》：An ART-fold Rhs toxin from Pluralibacter gergoviae defines Tne5, a novel family of NAD(P) glycohydrolases effectors

　　

研究人员发现，VI型分泌系统（Type VI Secretion System, T6SS）是一种广泛存在的细菌纳米机器，可通过将毒性效应蛋白递送至邻近细胞介导种间竞争。其中靶向烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其磷酸化形式（NAD和NADP，统称NAD(P)）的酶类因可快速破坏氧化还原稳态与中心代谢而具有极强杀伤活性，目前已鉴定出Tne1至Tne4四个T6SS相关NAD(P)消耗型效应蛋白家族。本研究针对Pluralibacter gergoviae（原名Enterobacter gergoviae）来源的T6SS相关Rhs毒素展开功能与机制解析。竞争实验表明，P. gergoviae以T6SS依赖方式杀灭大肠杆菌（Escherichia coli）。异源表达实验显示，该Rhs蛋白C端延伸区（RhsPg-CT）在大肠杆菌胞质中具有毒性，且与下游编码蛋白共表达可中和该毒性。AlphaFold3结构预测提示该毒素采用ADP-核糖基转移酶（ADP-ribosyltransferase, ART）样α/β折叠，其催化口袋可容纳NADH。与已报道T6SS ART毒素不同，该毒素不抑制转录或翻译，而是在体外消耗NAD(P)、在中毒细胞内导致胞内NAD耗竭。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）分析进一步证实，该毒素可将NAD+水解为烟酰胺（nicotinamide）与ADP-核糖（ADP-ribose）。系统发育分析与结构建模表明，该效应蛋白定义了一个广泛分布于拮抗系统的新型ART相关NAD(P)糖水解酶家族，研究人员将其命名为Tne5。

论文解读：《来自Pluralibacter gergoviae的一种具有ART折叠结构的Rhs毒素定义了Tne5——一个新的NAD(P)糖水解酶效应蛋白家族》

研究背景与意义

细菌在密集微生境中通过部署抗菌武器争夺营养与空间，VI型分泌系统（T6SS）是其中关键的分子机器，属于收缩注射系统超家族，通过收缩机制将效应蛋白注入靶细胞，调控微生物群落组成、促进生态位定殖。T6SS效应蛋白包含独立多肽及多态毒素（Polymorphic Toxins, PTs）——后者由N端转运结构域与C端毒性结构域融合而成，Rhs（Rearrangement hot spot）结构域是PTs的典型代表，可形成包裹毒性C端延伸区的“茧”状结构。在已发现的效应蛋白中，靶向烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及其磷酸化形式（NADP，统称NAD(P)）的酶类因直接破坏氧化还原平衡与核心代谢而备受关注，这类酶包括ADP-核糖基转移酶（ART）、NAD(P)糖水解酶（NADase）和ADP-核糖环化酶（ARC），此前已被归类为Tne1至Tne4四个家族。然而，ART样折叠的多样性及其在细菌竞争中的功能演化仍有待探索。本研究以环境分离菌Pluralibacter gergoviae（曾用名Enterobacter gergoviae）为对象，解析其T6SS编码的新型Rhs毒素的功能与机制，旨在拓展对NAD(P)靶向效应蛋白家族多样性的认知。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

关键技术方法

研究人员采用多学科交叉策略：首先通过生物信息学筛选P. gergoviae ATCC33028基因组中的T6SS基因簇；利用同源重组构建tssL突变株与Δrhs^Pg-CT-imm缺失株，结合氯酚红-β-D-半乳糖苷（CPRG）裂解关联β-半乳糖苷酶实验开展种间竞争测定；通过异源表达系统在大肠杆菌中验证Rhs^PgC端延伸区（Rhs^Pg-CT）的细胞毒性及免疫蛋白的中和作用；采用AlphaFold3进行结构建模，预测毒素折叠、配体结合口袋及毒素-免疫蛋白复合物互作模式；通过点突变结合毒性表型分析验证关键催化残基功能；利用体外偶联转录翻译（IVT）系统检测对转录翻译的影响，通过生物素标记NAD⁺实验检测蛋白ADP-核糖基化修饰；采用发光法测定胞内NAD水平，荧光法检测体外NAD(P)降解活性，核磁共振（NMR）光谱鉴定反应产物；最后通过JackHMMER同源搜索与最大似然法系统发育分析明确Tne5家族的分布与进化地位。

研究结果

A T6SS locus in Pluralibacter gergoviae mediates antibacterial activity

研究人员通过基因组筛选发现P. gergoviae ATCC33028携带完整T6SS基因簇，包含核心tssA-M基因、辅助tag模块及Tae4-Tai4毒素-免疫对、VgrG刺突、Rhs蛋白及其下游免疫蛋白等元件。种间竞争实验表明，野生型菌株可高效杀灭大肠杆菌W3110，而tssL突变株丧失杀菌活性，证实该T6SS具有抗菌功能。

The P. gergoviae T6SS encodes a Rhs polymorphic toxin

Rhs^Pg蛋白全长1503个氨基酸，具有典型Rhs多态毒素模块化结构：N端含PAAR结构域（aa 1-301，负责结合VgrG刺突）与跨膜结构域（TMD，aa 16-97，由上游eagR编码的分子伴侣保护）；中央为YD重复Rhs封装壳（aa 302-1329）；C端延伸区（aa 1330-1503，Rhs^Pg-CT）为潜在毒性区域，两端存在保守自切割位点。AlphaFold3建模证实Rhs^Pg的C端延伸区被封装于Rhs核心壳内，N端与VgrG形成复合物，EagR二聚体环绕TMD。异源表达实验显示，Rhs^Pg-CT在大肠杆菌胞质中表达导致生长抑制，而与下游A8H26_06350基因共表达可恢复生长，证实二者为毒素-免疫对。

Rhs^Pg-CT shares a typical ADP-ribosyltransferase fold

AlphaFold3建模显示Rhs^Pg-CT采用ART样α/β折叠，核心由5条β链（β5-β2/β1-β3-β6）组成的分裂β片层构成，缺失典型ART的β4链，形成容纳NADH的催化裂隙。序列与建模分析提示Lys1392与Glu1482可能参与催化口袋形成；毒素-免疫蛋白复合物模型显示免疫蛋白环深入裂隙，空间阻断NAD(P)结合。点突变实验表明，K1392A突变显著削弱毒性，而E1482A突变影响微弱。

Rhs^Pg-CT does not inhibit transcription or translation, and does not detectably ADP-ribosylate proteins

体外偶联转录翻译实验显示，Rhs^Pg-CT不影响绿色荧光蛋白（GFP）的合成，表明其不抑制转录或翻译。生物素-NAD⁺标记实验未检测到细胞内蛋白的ADP-核糖基化修饰，排除其作为经典ART的功能。

Rhs^Pg-CT has NAD(P)⁺glycohydrolase activity

胞内NAD定量实验表明，表达野生型Rhs^Pg-CT的大肠杆菌胞内NAD水平显著下降，共表达免疫蛋白可阻断该耗竭效应；K1392A突变体耗竭能力减弱，E1482A突变体无显著影响。体外荧光实验显示，Rhs^Pg-CT可同时降解NAD⁺与NADPH，活性与Pantoea ananatis ARC^tox相当，而Photorhabdus laumondii ART Tre23无此活性。NMR光谱分析证实，Rhs^Pg-CT将NAD⁺水解为烟酰胺与ADP-核糖，明确其NAD(P)糖水解酶活性。

Phylogenetic analyses define a new ART-related NADase clade, Tne5

最大似然系统发育树显示，Rhs^Pg-CT独立于已报道的Tne1-Tne4家族，形成单独分支。JackHMMER同源搜索发现Tne5同源蛋白广泛分布于T6SS、接触依赖性生长抑制（CDI）、VII型分泌系统（T7SS）相关多态毒素中，甚至在线虫与水螅的ShK模块融合蛋白中也存在远缘同源物，表明其为进化上成功的广谱拮抗效应家族。

讨论与结论

研究人员通过结构与功能分析证实，P. gergoviae Rhs^Pg-CT虽具有ART样折叠，但通过水解NAD(P)而非转移ADP-核糖发挥毒性，其催化口袋的Lys1392为主要功能残基，Glu1482非必需，体现了ART样支架的功能可塑性。Tne5家族的发现拓展了T6SS相关NAD(P)消耗型效应蛋白的多样性，支持“NAD(P)耗竭是跨分泌系统保守抗菌策略”的观点。该家族的广泛分布暗示其在微生物竞争与真核-原核互作中可能具有重要功能，为理解细菌拮抗机制的进化提供了新视角。