《Smart Medicine》：Freeze-Derived Microporous Biomaterials for Tissue Engineering Applications
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组织工程学通过实现功能性、患者特异性组织和器官的制造以用于临床转化，在革新再生医学方面展现出巨大的前景，然而，其在设计能够同时模拟天然组织结构、支持细胞活力并实现高效物质传输的支架方面仍面临持续挑战。传统的制造技术虽推动了该领域的发展，但往往难以在温和条件下制
组织工程学通过实现功能性、患者特异性组织和器官的制造以用于临床转化，在革新再生医学方面展现出巨大的前景，然而，其在设计能够同时模拟天然组织结构、支持细胞活力并实现高效物质传输的支架方面仍面临持续挑战。传统的制造技术虽推动了该领域的发展，但往往难以在温和条件下制备出具有层级化和各向异性特征的仿生结构。冰模板法（或称冷冻铸造），基于冷冻诱导的微相分离原理，将这一问题重构为晶体生长工程。本综述从物理和化学角度总结了冰模板技术的当前制造策略及其潜在机制。随后，重点介绍了冰模板法在三维（3D）细胞培养、伤口愈合、骨再生、神经修复和肝脏支持等组织工程应用领域的最新进展，强调了微观结构与生物医学功能性能之间的关系。最后，讨论了将冰模板生物材料从实验室研究转化为临床实践所面临的关键挑战，并概述了充分挖掘这一多功能生物医学策略潜力的未来发展方向。
冰模板制造技术及其潜在机制
自 2006 年首篇关于冷冻铸造的科学论文发表以来，该技术已发展近 20 年，并广泛应用于仿生结构力学、隔热、能源、环境及电气等多个领域。来自这些多样化应用的技术反馈反过来持续推动了冷冻铸造技术的演进。许多其他技术已被整合用于处理前驱体溶液。例如，热工程方法（如使用翅片或楔形基底产生温度梯度）催生了双向冰模板技术；3D 打印在宏观结构设计上的灵活性与精确性已与冰模板的微观结构控制相结合，开发出用于制造多尺度功能器件的 3D 冷冻打印技术；在化学领域，自由基聚合可在冷冻条件下引发，从而实现冰模板材料的原位聚合，无需后续冷冻干燥，显著降低了时间和经济成本。本章回顾了冷冻铸造技术的最新进展，并将其分为物理和化学两类方法。
物理冰模板策略
各向同性冰模板策略：在冷冻铸造过程中，前驱体溶液中的水相成核结晶，而非水相成分被生长的冰晶排出，导致微相分离。若将前驱体直接浸入液氮、冰箱或低温酒精溶液中，会发生随机冷冻，冰晶向各个方向自由生长。经后续冷冻干燥后，获得具有随机孔隙分布的各向同性冰模板材料。该策略主要关注孔径而非取向，通常通过调节冷冻温度和添加剂类型来控制冰晶尺寸，进而获得具有理想孔径的功能材料，常用于气凝胶、防火及隔热材料。
单向冰模板策略：针对需要微通道进行液体或离子传输的应用，发展出了单向冰模板技术。该技术通常在垂直方向建立单一温度梯度，引导冰晶沿该轴连续生长，形成贯通的微通道。常用策略是将高导热基底（如铜板）直接浸入液氮或置于热电帕尔贴冷台上，利用液氮的超低温和基底的高热扩散率，在基底与周围空气间形成陡峭的局部温度梯度。在此热场中，前驱体沿热流方向通过连续的冰晶生长而固化。其典型特征是横截面上孔隙随机分布，而纵向上呈现连续的通道结构。
双向冰模板策略：为模仿珍珠层状微结构以实现高强度与高韧性的结合，发展了双向冰模板技术。其基本原理是在三维空间的两个方向上建立温度梯度，使冰晶同时沿这两个方向生长形成冰片，而非水相成分被压缩并集中于其间。通常采用楔形基底，利用其倾斜表面的切向和法向温度梯度促进冰晶沿双轴生长。制备的材料呈现类珍珠层的片层形态，片层间的空隙可填充树脂等材料以增强机械性能。
径向冰模板策略：针对肝脏和骨骼等生物组织中存在的径向结构，可通过建立沿圆周 - 径向方向的温度梯度来实现。通常使用高导热材料（如铜或铝）制成的圆柱形模具，将其底端浸入液氮，从而在圆柱壁与中心空气间建立明显的径向温度梯度。冷冻铸造过程中，冰晶从圆周向中心沿径向生长，经冷冻干燥后得到具有中心径向取向结构的材料。
离子特异性冰重结晶辅助冰模板策略：冰重结晶是指冷冻过程中初始形成的冰晶发生重排和合并，导致小晶体消失和大晶体生长的过程。通过调节退火时间以及溶液中离子的类型和浓度（如 I? > Br? > F?），可精确控制重结晶冰晶的尺寸（从几十微米到几百微米不等），进而调控多孔生物材料的孔径。这种对孔径的精确控制为编程药物释放动力学提供了有力手段，可设计从快速释放到长效缓释的不同系统。
3D 打印辅助冰模板策略：3D 冷冻打印结合了 3D 打印的宏观几何形状定制能力与冰模板的微观孔隙结构调控能力。3D 打印提供宏观层面的灵活控制，而冰模板微调微观孔隙架构。这种协同方法不仅能快速制造复杂的多孔结构，还能调整热/电路径、设计各向异性绝缘通道，并提升机械和电学性能。
反复冻融辅助冰模板策略：该策略通过冰晶的形成与熔化部分复制冰晶结构，实现材料的物理交联和结构调控。以聚乙烯醇（PVA）为例，冷冻过程中聚合物链被排入冰晶间隙，增加链间接触并促进缠结和氢键形成；升温融化后留下多孔结构。多次循环可增强链的排列和折叠，产生具有半结晶特征的冰模板水凝胶。引入其他含羟基聚合物链可进一步增强氢键，提高机械强度。
表面图案辅助冰模板策略：利用高导热材料制造带有激光蚀刻凹坑的图案化基底，通过凹坑产生的高导热区与低导热空气隙之间的局部温度梯度，引导冰晶沿特定方向生长。该方法具有高可控性和设计灵活性，可实现从宏观到微观的多尺度取向控制，赋予材料优异的机械和功能特性。
化学冰模板策略
冰限域原位低温聚合策略：将化学反应引入冰模板技术，在低温下直接锁定冰晶结构。单体和交联剂在冰晶生长过程中被排入浓缩液相，在受限空间内发生化学交联，随后升温进行原位聚合以进一步稳固网络。相比传统物理方法，该策略显著缩短了处理时间，提高了效率，并降低了模板融化时的结构坍塌风险。
冰限域光聚合策略：结合紫外（UV）光聚合与冷冻铸造技术。在低温冷冻条件下，利用 UV 光引发自由基聚合，将被隔离并浓缩在冰晶间隙中的可聚合组分固化为网络结构，从而在冰融化前锁定其形态。该方法操作简便、效率高，适用于湿态最终产品，避免了干燥或融化过程中的结构坍塌。
冰限域界面合成策略：利用冰晶的限域和逐渐释放效应，精确控制界面聚合反应。首先冻结含有一种反应物的水溶液，然后在室温下将另一种反应物的有机相溶液涂覆于冰表面。随着冰逐渐融化，水相反应物缓慢释放至反应界面与有机相反应。该方法可精细调控膜结构和性能，提高分子通道分布和排列。
冰溶解 - 络合策略：旨在解决传统冷冻干燥耗时长的方法。将完全冷冻的聚电解质冻块直接浸入预冷的金属离子/有机溶液中。在此过程中，冰晶在有机溶剂中迅速溶解，同时聚电解质与金属离子发生络合反应，瞬间锁定由冰晶形成的孔隙或定向通道。该方法无需冷冻干燥，去冰时间比传统方法快 30-50 倍，并有效防止了结构坍塌。
组织工程应用中冰模板技术的进展
在细胞培养和再生医学中，支架系统提供支持细胞粘附、增殖、分化和组织形成的动态结构环境。冰模板技术因其能够可控地制造集大孔性、结构取向和机械强度于一体的三维结构而备受关注。这种独特的结构能够物理引导细胞的定向迁移、排列和分化，解决了许多随机多孔支架难以实现的难题。此外，其形成的大孔（通常>50 μm）和优异的孔隙连通性为细胞迁移、增殖及血管长入提供了必要的物理空间，有效防止细胞仅局限于表面。冰模板结构还具有出色的机械性能和结构稳定性，其致密的孔壁和沿冷冻方向形成的取向结构使其具有优越的压缩和拉伸性能，特别适用于骨和软骨等承重组织的修复。
三维细胞培养支架：冰模板法可在低温下操作，避免使用热量或有毒试剂，保护热敏性生物分子。通过调节冷冻参数，可精确控制支架的孔径和空间架构，模拟特定的组织微环境。例如，利用氨蒸气改性冷冻铸造的胶原支架，可形成具有分层微结构的纤维状胶原基质，引导肌母细胞沿层状孔隙定向迁移。人发角蛋白经定向冷冻铸造后形成的具有高度取向通道的 3D 支架，显著增强了细胞的迁移距离，展示了其在修复肌腱和韧带等各向异性软组织方面的潜力。
伤口愈合：定向排列的微通道为营养和废物运输提供了路径，促进细胞迁移和血管生成。结合微流控和定向冷冻铸造技术制备的微球系统，可封装过表达肝细胞生长因子的间充质干细胞，实现持续释放并促进血管新生，显著提高皮肤伤口修复效率。此外，结合 3D 打印牺牲模板与冰模板的混合策略，构建了包含宏观和微观通道的支架，显著改善了成骨细胞的浸润，并支持内皮细胞驱动的微血管网络形成。
骨再生：冰模板水凝胶因其高度连通的孔隙网络和强机械稳定性，成为细胞递送的理想载体。通过梯度冷却冷冻凝胶法制备的 GelMA 多孔形状记忆微球，可精确调控孔径以利于细胞粘附和增殖，并在体内促进血管化骨样组织的形成。径向冰模板支架通过精确控制孔径和取向，不仅能引导细胞深入支架内部，还能有效阻挡非成骨细胞和纤维组织的侵入，在修复板状和空腔骨缺损方面表现出独特优势。
神经导管：针对周围神经损伤，冰模板导电神经导管利用其独特的取向拓扑结构引导轴突定向生长，并结合电导率和神经生长因子释放功能，促进神经再生。对于脊髓损伤，具有分级取向通道的仿生神经导管可实现间充质干细胞和施万细胞的空间定位分布，模拟天然脊髓的时空细胞分布，有效桥接损伤间隙并促进组织再生。
急性肝衰竭：冰模板微载体系统可用于间充质干细胞的递送治疗急性肝衰竭。由氧化石墨烯、聚（N-异丙基丙烯酰胺）和 GelMA 组成的微载体，利用光热效应和热响应性实现受控释放。此外，利用离子特异性冰重结晶辅助技术构建的微载体，可重建模拟成熟肝细胞生长的三维微环境，在高密度肝细胞培养中表现出增强的生物功能，显著提高了急性肝衰竭模型的存活率。
总结与展望
综上所述，冰模板技术已成为制造具有精确调控架构的组织工程材料的强大且通用的策略。通过利用物理和化学冰模板策略，该技术能够构建模仿天然组织结构的层级化、各向异性和互连多孔网络。尽管在细胞培养、伤口愈合、骨再生、神经导管和肝脏工程等领域取得了显著进展，但在实现广泛临床转化之前仍需克服若干挑战。首先，冰晶生长动力学、所得孔隙结构与后续生物性能之间的机制关系尚不完全清楚，限制了针对特定医疗需求的理性设计。其次，材料范围虽广，但在机械强度、降解速率和生物活性之间仍面临权衡，部分功能材料在冷冻过程中稳定性或分散性较差。第三，对冷冻条件、溶液成分和结构固定方法的敏感性阻碍了大规模制造的规模和可重复性。第四，缺乏标准化的评估方案、长期的体内安全性数据以及针对此类复杂结构生物材料的监管途径。最后，目前大多数研究集中于单一功能设计，而临床场景往往需要多功能平台。未来的研究方向包括开发结合人工智能的多尺度定量模型以预测支架结构，扩展材料库至新型可降解聚合物和生物活性陶瓷，以及与 3D 打印、微流控和外场控制等先进制造技术集成，以实现可编程和患者特异性的架构。此外，结合光热材料实现光响应智能药物释放，以及开发具有细胞感知功能的设备，将是重要的发展方向。虽然基于传统冷冻干燥的冰模板产品（如 Integra 真皮再生模板）已成功上市，但具有各向异性孔隙结构等新兴冰模板技术尚未进入临床阶段。随着对结构 - 性能关系理解的深入，这些新兴技术在开发下一代高性能植入物方面具有广阔前景。
