《Journal of Controlled Release》：Biomimetic lipid nanoparticles for macrophage reprogramming in cancer immunotherapy
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Seunghyo Ko | Ga-Hyun Bae | Eun-Young Koh | Seungyong Shin | Joo Dong Park | Ha Eun Shin | Wooram Park
韩国成均馆大学（SKKU）生物技术与生物工程学院综合生物技术系，Seobu
Seunghyo Ko | Ga-Hyun Bae | Eun-Young Koh | Seungyong Shin | Joo Dong Park | Ha Eun Shin | Wooram Park
韩国成均馆大学（SKKU）生物技术与生物工程学院综合生物技术系，Seobu-ro 2066，Suwon，Gyeonggi 16419，大韩民国
摘要
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤微环境（TME）中主要表现出免疫抑制的M2表型，这阻碍了癌症免疫疗法的效果。为了解决这个问题，我们开发了一种双仿生巨噬细胞靶向脂质纳米颗粒（Mac LNP）平台，以实现从M2到M1的强大重编程。通过整合甘油三酯和磷脂酰丝氨酸来模拟乳糜微粒和凋亡小体，Mac LNP对巨噬细胞的选择性显著高于非靶细胞。该平台共封装了TLR9激动剂（CpG-ODN）和STAT3 siRNA，以协同驱动M1极化，同时沉默维持M2状态的主要转录因子。在4T1同源乳腺癌模型中，瘤内注射Mac LNPs显著抑制了肿瘤生长，并重塑了免疫景观，表现为M1/M2比率显著增加以及细胞毒性CD8+ T细胞的浸润增强。在独立的CT26小鼠结直肠癌模型中的跨模型验证进一步证实了该平台的肿瘤普适性。我们的发现确立了Mac LNP系统作为巨噬细胞靶向RNA治疗的精确框架，有效调节先天免疫以克服TME的免疫抑制屏障。
引言
恶性实体瘤不仅仅是癌细胞的简单聚集；相反，它们是由血管、肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质和信号分子组成的复杂生态系统[1]，[2]。这些成分共同构成了一个免疫抑制的肿瘤微环境（TME），使传统疗法难以发挥作用[3]，[4]，[5]。TME建立了强大的物理和免疫学屏障，阻碍了细胞毒性淋巴细胞的浸润和效应功能，常常降低化疗和免疫检查点抑制剂的疗效[6]，[7]。在这些基质成分中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是最丰富的浸润白细胞，并且是免疫抑制环境的关键驱动因素[8]，[9]。因此，通过精确靶向TAMs来重塑TME的策略对于克服药物耐药性和恢复抗肿瘤免疫具有重大潜力[10]，[11]，[12]。
巨噬细胞具有显著的可塑性，能够根据环境信号动态调整其表型[13]。尽管将其简单地分为抗肿瘤的M1表型和促肿瘤的M2表型，但在TME中的TAMs主要倾向于采用M2表型[14]，[15]。这些M2表型的TAMs分泌抗炎因子，促进血管生成，并促进癌症转移[16]，[17]。相反，M1极化的巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子（包括TNF-α和IL-6）发挥强大的抗肿瘤作用。此外，它们在协调先天免疫和适应性免疫之间起着关键作用，通过招募细胞毒性T细胞并增强树突状细胞（DCs）的抗原呈递功能[18]。因此，将促进肿瘤的M2 TAMs重新极化为抗肿瘤的M1 TAMs是一个重要的治疗目标[19]，[20]。然而，使用小分子药物或抗体的传统药理学尝试在临床上的成功有限，主要是由于瘤内积累不足和全身毒性[21]，[22]，[23]。
为了克服这些障碍，我们建立了一种基因免疫疗法策略，同时递送CpG-ODN和STAT3 siRNA[24]，[25]。CpG-ODN是一种强效的Toll样受体9（TLR9）激动剂，可触发M1巨噬细胞激活，刺激促炎细胞因子的分泌，并增强抗原呈递能力和细胞毒性T细胞反应[26]，[27]。另一方面，STAT3是调控M2极化的关键转录因子[28]，[29]。因此，靶向STAT3的siRNA消除了这一主要调节因子，从而防止表型逆转并确保持续的促炎状态。我们假设这种同时敲低M2诱导因子STAT3和刺激M1诱导因子CpG-ODN的组合策略会产生协同效应，比单一疗法具有更好的巨噬细胞重编程效果。
然而，裸露的核酸治疗受到其内在不稳定性的限制，快速全身清除以及在密集肿瘤组织中无法选择性积累的问题[21]，[30]，[31]，[32]。为了缓解这些限制，脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种临床验证的递送载体出现，能够稳定封装核酸并促进细胞质递送[33]，[34]，[35]。然而，传统的LNP配方通常缺乏细胞特异性，常常导致非靶细胞积累而不是精确递送到肿瘤内的特定细胞类型[32]，[36]，[37]，[38]。为了规避这些递送障碍，我们设计了一种仿生LNP平台，利用巨噬细胞的固有生物学特性。具体来说，为了在肿瘤微环境内实现靶向细胞内化和递送特异性之间的桥梁，我们设计了一种双功能化的LNP表面，利用了吞噬清除机制（通过磷脂酰丝氨酸，PS）和TAMs的高代谢需求（通过甘油三酯，TG）。通过将PS整合到LNP组成中以模拟凋亡小体的“吃我”信号，我们促进了巨噬细胞表面大量表达的PS受体（TIM-4，MerTK）的主动摄取[39]，[40]，[41]，[42]。同时，我们在LNP核心中加入了TG以模拟乳糜微粒结构。这种对富含甘油三酯的脂蛋白的结构模仿促进了通过清除受体的优先摄取，这些受体在代谢活跃的TAMs中显著上调，以满足其高脂质需求[43]，[44]。
因此，我们开发了一种仿生纳米载体，旨在穿越肿瘤基质的生物屏障并实现向TAMs的精确递送。通过策略性地结合TG和PS，所得的“Mac LNP”利用了TAMs的天然代谢亲和力，确保选择性积累，同时最小化非靶分布（图1a）。我们设想通过该平台共同递送CpG-ODN和STAT3 siRNA将实现协同的免疫调节。具体来说，沉默STAT3介导的免疫抑制轴可以防止M2表型逆转，从而为CpG-ODN介导的TLR9激活创造有利环境。最终，这种双重调节策略实现了从促肿瘤的M2表型向抗肿瘤的M1表型的转变，并通过细胞毒性T细胞激活重新激活全身免疫（图1b）。在这里，我们在高度免疫抑制的4T1乳腺癌模型中全面验证了Mac LNPs的靶向效率、机制协同性和治疗安全性，并在独立的CT26结直肠癌模型中进一步确认了跨肿瘤的适用性，共同建立了一个新的精确巨噬细胞靶向免疫治疗框架。
部分摘录
材料
SM-102从MedChemExpress（美国新泽西州Monmouth Junction）获得。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）从Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州Alabaster）获得。胆固醇和甘油三油酸酯（Triolein）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，而tricaprin从Tokyo Chemical Industry（日本东京）购买。
巨噬细胞靶向LNPs的配方和优化
在这项研究中，我们基于FDA批准的离子化脂质SM-102开发了一种巨噬细胞靶向脂质纳米颗粒（Mac LNP）平台，以优化靶向特异性。初步筛选时，通过将脂质溶液与稀释在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中的萤火虫荧光素mRNA快速涡旋混合来制备LNPs[45]，[46]。我们通过比较小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）与非靶人类胚胎细胞的转染效率来评估基因递送选择性
讨论
免疫抑制的TME构成了一个巨大的障碍，显著限制了癌症免疫疗法的效果[7]。在这个复杂的生态系统中，TAMs是主要的免疫群体。不幸的是，恶性细胞积极地破坏这些巨噬细胞，使其趋向于M2表型，从而促进肿瘤进展、血管生成和转移[8]。
尽管将这些促肿瘤的TAMs重新编程为抗肿瘤的M1表型是一个有吸引力的
结论
在这项研究中，我们成功开发了一种双仿生脂质纳米颗粒平台（Mac LNP），旨在克服与TAMs相关的递送障碍。通过策略性地结合TG和PS来模拟乳糜微粒和凋亡小体的生化特征，Mac LNPs实现了比传统LNPs更高的巨噬细胞选择性和更好的细胞内递送效率。CpG-ODN和STAT3 siRNA的共同递送产生了强大的协同效应，有效
CRediT作者贡献声明
Seunghyo Ko：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，验证，软件，资源，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。Ga-Hyun Bae：写作 – 审稿与编辑，方法学，调查，正式分析，数据管理。Eun-Young Koh：方法学，调查，正式分析，数据管理。Seungyong Shin：调查，正式分析，数据管理。Joo Dong Park：正式分析，数据管理。Ha Eun Shin：写作 – 审稿与
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府（科学技术信息通信部，MSIT）资助（RS-2024-00350878 和 RS-2023-00242443）；韩国再生医学基金（KFRM）的资助，该基金由MSIT和卫生福利部共同资助（RS-2025-02223118）；韩国基础科学研究所（国家研究设施和设备中心）的资助，该研究所由韩国政府（MSIT）资助（RS-2024-00402899）；以及基础科学研究
