《Journal of Controlled Release》：Rapid receptor internalization potentiates CD7-targeted lipid nanoparticles for efficient mRNA delivery to T cells and in vivo CAR T-cell engineering
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Jianhao Zeng|Tyler Ellis Papp|Awurama Akyianu|Alejandra Bahena|Lanfranco Leo|Faris Halilovic|Hamideh Parhiz宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院系统药理学与转化治疗学系，美国费城，宾
Jianhao Zeng|Tyler Ellis Papp|Awurama Akyianu|Alejandra Bahena|Lanfranco Leo|Faris Halilovic|Hamideh Parhiz
宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院系统药理学与转化治疗学系，美国费城，宾夕法尼亚州
摘要
靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）能够高效地将mRNA递送到T细胞中，从而在体内生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞，而无需体外操作。这种策略在心脏纤维化、癌症和自身免疫性疾病的临床前研究中显示出有希望的治疗效果。尽管在多项研究中针对T细胞表面受体使用了tLNP介导的体内CAR T细胞生成方法，并且这些方法的效率各不相同，但它们之间的比较性能及其背后的机制仍不清楚。在这里，我们在相同的条件下系统地比较了针对CD2、CD4、CD5、CD7或CD4+8双重靶点的tLNPs，评估了它们在体外人类T细胞和PBMC中的mRNA递送效率，并在人源化小鼠中验证了表现最佳的tLNPs。在所有测试的组分中，针对CD7的tLNPs实现了最高的mRNA递送效率，并在体内有效生成了功能性aCD20 CAR T细胞。机制分析表明，受体内化而非受体丰度是递送效率的主要决定因素，这一特性是每个受体固有的，且很大程度上独立于抗体克隆。这些发现为选择最佳的靶向组分以实现高效的体内CAR T细胞工程提供了理论依据。
引言
通过脂质纳米颗粒（LNPs）递送的信使RNA（mRNA）已成为疫苗、癌症治疗和基因疗法开发中的变革性平台[1]、[2]、[3]、[4]。一种特别有吸引力的方法是使用LNP-mRNA在体内直接生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞。CAR T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗，实现了持久的缓解甚至治愈[5]、[6]、[7]、[8]。然而，目前的CAR T细胞制造依赖于复杂的体外工程流程，包括白细胞分离、病毒转导、扩增、质量控制和再输注，这些过程技术要求高、成本高昂，且只能在专门的GMP设施中进行[9]、[10]。此外，还需要通过化疗进行淋巴细胞清除[11]、[12]、[13]。病毒诱导的T细胞中CAR的长期表达可能导致细胞因子的持续释放和健康B细胞的长期耗竭，从而引发细胞因子释放综合征、长期的免疫抑制和感染风险增加[6]、[14]、[15]、[16]。相比之下，使用LNP-mRNA在体内生成CAR T细胞可以克服许多这些限制。这种方法消除了细胞分离和体外操作的需要，从而大大简化了制造过程。在体内工程化内源性T细胞也无需化疗预处理，并减少了相关毒性。此外，mRNA能够实现CAR的短暂表达，降低了与CAR T细胞长期活性相关的风险，并允许时间控制以最小化毒性[17]、[18]、[19]。
实现高效体内mRNA递送到T细胞（从而实现体内CAR T细胞生成）的一个重大突破是靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的开发。与巨噬细胞或树突状细胞不同，T细胞的吞噬活性有限，无法有效摄取未经修饰的常规LNP-mRNA。tLNP平台通过将靶向组分（如识别T细胞表面受体的单克隆抗体）连接到LNP表面，引导LNP与T细胞的结合并触发受体介导的内吞作用，从而解决了这一问题。这种策略能够在全身给药后高效且选择性地将mRNA递送到T细胞[20]、[21]、[22]。tLNP介导的体内CAR T细胞生成在多项临床前和临床研究中显示出显著的效果。Rurik等人证明，aCD5/tLNPs能够在体内生成抗FAP CAR T细胞，从而逆转小鼠的心脏纤维化[22]。Hunter等人报告称，aCD8/tLNPs能够在体内生成抗CD19 CAR T细胞，并在非人灵长类自身免疫疾病模型中引发“免疫重置”[18]。最近，Wang等人使用aCD8/tLNPs在系统性红斑狼疮患者体内直接生成抗CD19 CAR T细胞，实现了显著的B细胞耗竭和致病性自身抗体的减少[23]。在这些研究中，tLNPs针对了不同的T细胞表面受体，每种受体的递送效率也有所不同[18]、[21]、[22]。然而，尚未有在相同实验条件下针对这些T细胞受体的tLNPs之间的直接性能比较。此外，不同靶向组分tLNPs表现差异的机制原理仍不明确。解决这些问题将有助于选择最佳的靶向受体和组分，以实现高效的体内CAR T细胞工程。
在这里，我们在统一条件下系统地比较了针对CD2、CD4、CD5、CD7或CD4+8双重靶点的tLNPs（以下简称CD4+8）。使用ZsGreen报告基因mRNA作为tLNPs的有效载荷，我们在纯化的人类T细胞和PBMC中定量比较了tLNPs的递送效率（其中T细胞与其他免疫细胞竞争），随后在人源化小鼠中验证了表现最佳的tLNPs。为了研究tLNPs递送效率的机制原理，我们测量了受体丰度，评估了多种抗体克隆的抗体-受体内化动力学，并量化了细胞内的mRNA积累和产生的蛋白质。对于表现最佳的tLNPs，我们进一步通过递送aCD20 CAR mRNA在体外和体内生成了CAR T细胞，以确定其功能相关性。我们发现，针对CD7的tLNPs实现了最高的mRNA递送效率，并在体外和体内有效生成了CAR T细胞。从机制上看，抗体-受体复合物的内化能力而非受体丰度是tLNPs递送效率的主要决定因素。这种内化能力似乎是每个受体固有的，且很大程度上独立于结合的抗体克隆。我们的发现为设计高效的体内CAR T细胞工程的tLNPs提供了最佳靶向组分的框架。
章节片段
mRNA合成
mRNA的制备遵循先前描述的方案[20]、[24]。在生成相应的mRNA编码序列之前，对编码蛋白质（例如ZsGreen）的氨基酸序列进行了密码子优化。用于体外转录的DNA模板包括T7启动子、5′ UTR、编码序列、3′ UTR和poly(A)尾，这些模板被合成并克隆到pUC-ccTEV-A101质粒载体中。质粒被线性化后用作体外转录的模板
评估不同靶向组分对体外tLNPs介导的mRNA递送到人类原代T细胞效率的影响
为了在统一实验条件下系统地评估不同靶向组分的相对性能，我们比较了与单克隆抗体结合的LNPs递送mRNA的效率，这些抗体针对几种高表达且特异性针对T细胞的表面标记物：CD2、CD4、CD5、CD7和CD4+8。抗体通过N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸（SATA）-马来酰亚胺化学方法（图1A，方法部分）[20]、[27]与LNP-mRNA共价结合。
讨论
抗体功能化的tLNPs已成为体内mRNA递送到T细胞以及直接在体内生成CAR T细胞的强大平台[19]。尽管多种T细胞表面受体（包括CD4、CD5、CD7和CD8）已被抗体功能化的tLNPs靶向[18]、[20]、[21]、[22]，但在相同条件下这些tLNPs递送mRNA到T细胞的相对性能及其效率差异的机制仍不清楚。
CRediT作者贡献声明
Jianhao Zeng：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。Tyler Ellis Papp：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、数据分析、概念化。Awurama Akyianu：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、数据分析。Alejandra Bahena：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。Lanfranco Leo：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。Faris Halilovic：撰写
资助
本研究得到了BioNTech SE（资助H.P.）和美国国立卫生研究院（NIH）的支持（通过T32 GM154643（资助A.B.）和R01 AI167061（资助H.P.））。
利益冲突声明
H.P.获得了BioNTech的研究支持。H.P.和T.E.P.是宾夕法尼亚大学的发明人，拥有一些在此展示的专利。这些利益已向宾夕法尼亚大学完全披露。
致谢
我们感谢人类免疫学核心团队的Max Eldabbas、Emileigh Maddox、Tanishk Sinha和Jiayi Shu在人类T细胞收集方面的协助。该核心团队部分得到了NIH资助P30 AI045008和P30 CA016520的支持。流式细胞术数据是在Penn Cytomics和Cell Sorting共享资源实验室（RRID:SCR_022376）生成的，该实验室部分得到了Abramson癌症中心NCI资助（P30 CA016520）。我们还要感谢消化系统分子研究中心的支持
