促微生物黏附的微复合材料能够将有益的口腔细菌输送到口腔中，从而恢复和调节口腔生物膜群落

《Journal of Controlled Release》：Promicrobial mucoadhesive micro-composites enable delivery of beneficial oral bacteria to restore and modulate oral biofilm communities

　　

哈里·J·哈维（Harry J. Harvey）| 莎拉·科里根（Sarah Corrigan）| 丹妮莱·巴伊奥科（Daniele Baiocco）| 张志兵（Zhibing Zhang）| 塔里克·H·伊克巴尔（Tariq H. Iqbal）| 温姆·特赫尔斯（Wim Teughels）| 艾恩·查普尔（Iain Chapple）| 理查德·D·霍尼布洛（Richard D. Horniblow）

伯明翰大学感染、炎症与免疫学学院生物医学科学系，埃德巴斯顿，伯明翰 B15 2TT，英国

摘要

口腔微生物组中的失衡（包含超过700种菌株类型）既会导致局部疾病（如牙周炎），也会引发系统性疾病（如类风湿性关节炎和心血管疾病）。鉴于传统抗菌剂在口腔疾病治疗中的过度使用以及现有干预策略的复发性问题，亟需创新的促微生物方法来恢复口腔生物膜群落。重要的是，目前存在一个关键的临床需求，即积极恢复并持续输送有益的口腔共生菌，而不是继续破坏已经失衡的微生物群落。

我们开发了一种促微生物制剂，将活的、与健康相关的口腔细菌封装在黏膜粘附性微复合材料中，以促进在模拟口腔流动条件下的有益生物膜的形成。我们将五种口腔细菌的生物活性菌群封装在藻酸盐微复合材料中，并对其表面进行了聚-L-赖氨酸修饰，以增强其在体外对人工唾液涂层的粘附能力。从微复合材料中释放出的细菌能够形成稳定的口腔生物膜。值得注意的是，通过改变封装的生物活性成分，可以调节生物膜的组成，从而实现定制化和针对性的生物膜恢复路径。

在代表性的唾液流动条件下，经过生物封装后的生物活性物质能够形成强大的生物膜，即使在存在致病菌的口腔菌群环境中也是如此，这突显了其在牙科生物膜生物工程中的潜在临床应用。在模拟牙周袋清创的实验中，我们观察到使用生物活性制剂后免疫调节作用增强，当将Limosilactobacillus reuteri纳入菌群时，致病菌的数量也有所减少。这些发现为使用缓释封装益生菌调节口腔微生物组提供了框架，为口腔健康护理中的促生物膜疗法带来了范式转变，并为口腔微生物组移植铺平了道路。

引言

人类口腔内栖息着由700多种细菌组成的复杂而动态的微生物群落[1]，这些细菌在维持口腔和全身健康方面起着至关重要的作用。这种微生物平衡的破坏（称为菌群失调）与多种口腔疾病相关，包括龋齿、牙龈炎和牙周炎[2]、[3]、[4]。促进健康的口腔微生物组与适当且有效的免疫炎症反应之间的共生关系是口腔健康的基础。由口腔菌群失调引起的炎症状态也是系统性非传染性疾病（NCD）的风险因素，例如糖尿病[5]、[6]、动脉粥样硬化性心血管疾病[7]、类风湿性关节炎[8]和结直肠癌[10]。事实上，仅牙周炎就影响了全球11亿人（12.5%）[11]，预计到2050年这一比例将上升至13.1%，直接治疗费用和间接费用将达到3280亿美元[12]。

口腔生物膜是附着在口腔内表面的结构化微生物群落，而口腔微生物组的失衡通常与其组成变化有关。虽然传统上认为生物膜具有致病性，但越来越多的证据表明，当由共生菌和有益菌组成时，生物膜对维持健康至关重要[13]。此外，现在认识到，致病菌（例如Porphyromonas gingivalis）的存在并不是疾病的唯一决定因素。相反，微生物组-宿主关系的破坏会导致免疫失调，进而促进致病菌的增殖，进一步影响宿主组织的损伤[14]。尽管健康和患病个体中致病菌的绝对数量有所不同，但通过调节生物膜群落可以逆转菌群失调，限制其进一步增殖和促进疾病的发展。

目前管理口腔疾病的常用方法通常涉及机械清除（例如牙周炎治疗中的龈下清创）和使用化学抗菌剂或抗生素作为辅助手段[15]。然而，这些方法缺乏针对性，可能会破坏有益的微生物种群。此外，这些方法往往无法防止菌群失调的再次发生[16]，约25%的患者病情会持续进展[17]。这突显了支持健康生物膜生长和建立的促微生物干预措施的潜在价值，这是一个亟待满足的临床需求。此类平台需要在口腔内实现持续释放，这也是当前口腔治疗的一个临床需求。此外，随着抗生素使用的增加，口腔已成为抗菌素耐药性的储存库[18]、[19]、[20]，因此需要替代治疗策略。

一种有前景的替代方法是使用益生菌来促进健康口腔微生物组的重建。益生菌是在适当剂量下能带来健康益处的活微生物，在肠道健康方面显示出显著潜力。虽然许多单一细菌种类与其口腔健康的关系已有充分记录[13]，但口腔微生物组由近千种细菌组成，许多细菌存在于复杂的群落和生物膜中[21]，而现有的口腔益生菌制剂通常只包含一两种细菌[22]、[23]、[24]、[25]，这可能限制了其应用效果。此外，这些细菌通常是冻干的，并通过传统方法（如注射或含片）引入宿主体内[23]；这些方法可能会降低益生菌的活性并延缓其在口腔中的生长和定植。多菌株益生菌可以通过重新引入能够形成稳定且成分平衡的生物膜群落来竞争性地排除病原体再定植，这是一种值得进一步研究的辅助策略。因此，开发能够形成稳定且成分平衡的活多微生物群落的引入途径将是一项重要的技术进步，可以克服制剂限制并增加可使用的菌株多样性。

将益生菌封装在生物材料中已成为提高其活性、释放和功能的关键策略。对于胃肠道应用，已在模拟胃肠道条件的微复合材料中封装A. municphilia，以确保其在到达目标部位后释放和建立[26]、[27]。此外，可以通过调整微复合材料的物理化学性质来响应环境信号，控制其降解并促进释放[26]。然而，将这项技术应用于口腔面临独特挑战，即i) 成功封装活的、有活力的口腔益生菌菌株；ii) 在唾液和牙龈沟液流动条件下保持封装细菌在口腔环境中的稳定性；iii) 促进封装细菌及其后代持续释放和多微生物生物膜的形成，尤其是在存在天然口腔菌群的情况下。

在这里，我们旨在通过开发一种促微生物递送制剂来解决这些挑战，该制剂由封装在黏膜粘附性生物材料支架中的活口腔细菌组成，能够在模拟口腔条件下分散并形成多微生物生物膜。这种方法支持开发一种新的治疗策略，以调节口腔微生物组并管理牙周炎等口腔疾病。为了展示其转化相关性，我们模拟了一个临床应用案例，即在该制剂作为龈下清创后的辅助手段使用，这是目前牙周治疗的常规标准。通过专注于促进有益的、与健康相关的生物膜的形成，而不是非特异性地消灭病原体，这项工作为口腔健康护理中的促微生物策略提供了范式转变。

章节片段

菌株和培养条件

本研究使用了八种细菌菌株。共生菌株：Streptococcus sanguinis（ATCC 10556）、Streptococcus oralis（NCTC 11427）、Actinomyces naeslundii（DSM 17233）、Corynebacterium matruchotii（DSM 20635）、Veillonella parvula（DSM 2007）、Limosilactobacillus reuteri（DSM 17938）。致病菌株：Fusobacterium nucleatum（ATC 43718）、Porphyromonas gingivalis W83。

细菌在Schaedler厌氧琼脂（Oxoid）上常规培养。肉汤培养物在改良的脑

藻酸盐微复合材料的制备和表征及其生物相容性评估

我们的目标是开发一种微复合材料（MC）封装平台，用于将活的口腔益生菌（与口腔健康相关的细菌）递送到模拟的口腔环境中，以形成稳定的多微生物生物膜。选择钠藻酸盐Gelcarin FF26（Alg）作为封装生物聚合物，因为它在钙离子存在下容易凝胶化，并且据报道与人类相关细菌具有高生物相容性[35]、[36]、[37]。

为了确定其作为口腔递送平台的适用性，我们

讨论

本研究探讨了使用AlgMC-PLL作为递送载体制备的口腔益生菌在恢复和建立与健康相关的口腔生物膜方面的潜在应用。早期的研究，特别是针对肠道益生菌的研究，主要集中在单一菌株的封装上，如Lactobacillus、Bifidobacterium和Akkermansia物种[26]，而探索旨在恢复口腔多微生物生物膜的封装技术的研究较少

CRediT作者贡献声明

哈里·J·哈维（Harry J. Harvey）：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。莎拉·科里根（Sarah Corrigan）：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。丹妮莱·巴伊奥科（Daniele Baiocco）：方法学、研究、概念化。张志兵（Zhibing Zhang）：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。塔里克·H·伊克巴尔（Tariq H. Iqbal）：监督、资源提供。温姆·特赫尔斯（Wim Teughels）：监督。艾恩·查普尔（Iain Chapple）：撰写——原始草稿、监督、资源提供。理查德·D·霍尼布洛（Richard D. Horniblow）：撰写——原始

资金声明

本研究由国家健康与护理研究所（NIHR）伯明翰生物医学研究中心（BRC）在炎症领域资助。所表达的观点仅代表作者本人，并不一定代表NIHR或卫生与社会护理部的立场。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢Wannes Van Holm和Mehraveh Saghi（鲁汶大学）的深入讨论和宝贵意见。