《RSC Advances》：A layered double hydroxide nanocarrier enables YM155 delivery-induced PANoptosis and immunogenic activation in hepatocellular carcinoma
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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）因固有的凋亡抵抗及对常规化疗反应有限，仍是致死率极高的恶性肿瘤。这一治疗瓶颈与异常的细胞死亡调控及免疫抑制性肿瘤微环境密切相关，共同限制了有效的肿瘤清除。本研究开发了一种基于层状双金属氢氧化
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）因固有的凋亡抵抗及对常规化疗反应有限，仍是致死率极高的恶性肿瘤。这一治疗瓶颈与异常的细胞死亡调控及免疫抑制性肿瘤微环境密切相关，共同限制了有效的肿瘤清除。本研究开发了一种基于层状双金属氢氧化物（layered double hydroxide, LDH）的YM155递送平台（LDH-YM155），旨在增强Survivin靶向治疗效果，同时将肿瘤细胞死亡重编程为炎症性和免疫原性表型。LDH-YM155表现出良好的理化稳定性、pH响应性YM155释放及高效细胞摄取，可在Hepa1-6细胞中触发显著的氧化应激与线粒体膜去极化。该应激级联反应激活了PANoptosis，其特征包括caspase-3、caspase-8和caspase-1活性升高、ASC斑点形成、磷酸化MLKL（p-MLKL）水平上调、Annexin V/PI阳性群体增加，以及NLRP3和RIPK3信号通路的上调。同时，LDH-YM155诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）相关事件，包括钙网蛋白（calreticulin, CRT）暴露增强、胞外高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）释放增加，以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放增多，进而通过肿瘤细胞条件培养基促进树突状细胞成熟。转录组学分析进一步证实，刺激应答与炎症信号通路被激活，与上述表型一致。在体内实验中，LDH-YM155显示出改善的肿瘤富集能力，并在Hepa1-6荷瘤小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，伴随Ki-67表达降低及TUNEL染色增加。重要的是，肿瘤组织染色验证了体内NLRP3、RIPK3和CRT信号升高，同时HMGB1滞留减少，支持炎症性与免疫原性肿瘤细胞死亡的诱导。进一步的免疫谱分析显示，肿瘤微环境中树突状细胞成熟增强、促炎性巨噬细胞极化增加，以及细胞毒性CD8+Granzyme B+T细胞活化上调。综上，这种基于LDH的纳米治疗策略通过将Survivin抑制与PANoptosis激活及ICD相关免疫刺激相耦合，增强了YM155的疗效，为肝细胞癌治疗提供了一个极具前景的平台。
该研究发表于《RSC Advances》，针对肝细胞癌（HCC）因凋亡抵抗导致治疗失败的临床难题，聚焦于生存素（Survivin，由BIRC5基因编码）这一凋亡抑制蛋白家族成员在肿瘤中的高表达及其与化疗耐药的关联。研究人员针对小分子Survivin抑制剂YM155存在的体内清除快、生物利用度低、肿瘤富集不足等药代动力学缺陷，构建了镁铝基层状双金属氢氧化物（MgAl-LDH）纳米载药系统（LDH-YM155），旨在通过纳米递送增强药物疗效，并探索其诱导新型程序性死亡方式PANoptosis（凋亡、焦亡、坏死性凋亡的协同死亡模式）及免疫原性细胞死亡（ICD）的潜力，从而重塑免疫抑制性肿瘤微环境。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：通过共沉淀法制备MgAl-LDH纳米片并负载YM155；利用扫描电子显微镜、原子力显微镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱及X射线光电子能谱对材料进行理化表征；建立小鼠皮下Hepa1-6肝癌模型评估体内分布与抗肿瘤效果；结合流式细胞术、免疫荧光、酶活性检测及转录组测序分析细胞死亡模式与免疫激活机制；通过组织染色与血液生化分析评估生物安全性。
研究结果如下：
3.1 LDH-YM155的制备与表征
通过共沉淀法成功合成LDH-YM155，其保留了层状结构，药物负载量达21.25%，包封率为27%。该纳米复合物在水、PBS及含血清培养基中分散稳定，且在pH 5.5酸性条件下药物释放速率显著高于生理pH 7.4，具备pH响应释放特性。
3.2 LDH-YM155的高效细胞内化与早期应激诱导
LDH-YM155通过网格蛋白介导的内吞途径被Hepa1-6细胞高效摄取，引起细胞内活性氧（ROS）水平显著升高及线粒体膜电位下降，并较游离YM155更有效地诱导细胞凋亡。
3.3 LDH-YM155抑制Survivin并诱导线粒体氧化应激
LDH-YM155在小鼠与人肝癌细胞中均表现出剂量依赖性细胞毒作用，可时间及剂量依赖性地抑制Survivin表达，同时诱导线粒体ROS积累及细胞色素c释放。
3.4 LDH-YM155诱导Hepa1-6细胞发生PANoptosis
抑制剂挽救实验表明，凋亡、焦亡、坏死性凋亡及氧化应激通路均参与LDH-YM155的细胞杀伤作用。机制上，其激活caspase-3/8介导的凋亡信号、NLRP3/ASC/caspase-1介导的焦亡信号，以及RIPK3/p-MLKL介导的坏死性凋亡信号，广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可阻断NLRP3与RIPK3的上调，证实其为caspase依赖的PANoptosis。
3.5 LDH-YM155促进ICD相关DAMP信号与树突状细胞成熟
LDH-YM155处理显著上调细胞表面钙网蛋白（CRT）暴露，促进HMGB1与ATP的胞外释放，并增加LDH释放。其条件培养基可有效促进树突状细胞（DC）的成熟，表现为CD80与CD86共表达上调。
3.6 转录组分析揭示与PANoptosis一致的应激与炎症信号
转录组测序显示，差异表达基因富集于氧化应激、炎症反应及IL-17、TNF、MAPK、NF-κB等炎症相关通路，同时pyroptosis与necroptosis相关基因集均发生显著改变，从分子层面支持PANoptosis的发生。
3.7 LDH-YM155的体内抗肿瘤功效
近红外成像证实LDH载体可增强药物的肿瘤富集。在Hepa1-6荷瘤小鼠模型中，静脉注射LDH-YM155显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率达69.75%，并降低肿瘤增殖标志物Ki-67表达，增加TUNEL阳性细胞比例。
3.8 LDH-YM155在体内激活PANoptosis相关DAMP信号并重塑肿瘤免疫微环境
体内实验证实，LDH-YM155处理上调肿瘤组织中NLRP3与RIPK3的表达，增加CRT暴露并减少HMGB1滞留。同时，其促进肿瘤内DC成熟、推动巨噬细胞向M1型极化，并增加细胞毒性CD8+Granzyme B+T细胞的活化。
3.9 LDH-YM155的体内外生物安全性评价
溶血实验显示LDH-YM155在各浓度下均无显著溶血作用。治疗期间小鼠体重稳定，主要脏器无病理损伤，血常规指标无异常，表明其具有良好的生物相容性。
讨论与结论部分指出，该研究开发的LDH-YM155纳米递送系统成功克服了YM155的药代动力学局限，通过将Survivin抑制与PANoptosis激活及ICD免疫刺激相结合，实现了对肝细胞癌的高效治疗。研究不仅提供了一种新的纳米治疗策略，也为克服凋亡抵抗型肿瘤的免疫治疗提供了新思路。
