D-亮氨酸修饰的 Sansalvamide A 类似物：光诱导合成、靶点预测及抗肿瘤潜力研究

《RSC Advances》：D-Leucine modified Sansalvamide A analogs: photo-induced synthesis, target prediction, and antitumor potential study

　　

环肽在癌症治疗中展现出希望，但受到天然产量低和代谢稳定性差的阻碍。本研究通过亮氨酸（Leu）构型修饰和绿色分子内光诱导单电子转移（SET）环化反应，合成了 Sansalvamide A 类似物（化合物 1–5），该方法将具有抗肿瘤活性的异吲哚啉酮引入骨架以增强结构刚性。体外 MTT 法测定显示，环肽表现出一定程度的肿瘤细胞抑制活性，其中化合物 5（具有多个 D-亮氨酸修饰）表现出相对较强的活性。靶点预测和蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）分析鉴定出 BCL2 为关键枢纽靶点，这一发现经分子对接进一步证实，结果显示化合物 5 通过稳定的氢键和疏水相互作用（包括烷基、π-阳离子和π-σ相互作用）与 BCL2 表现出高结合亲和力。同时，JC-1 实验证实化合物 5 能有效降低线粒体膜电位（MMP），从而赋予其诱导肿瘤细胞凋亡的潜力。计算机辅助的吸附、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测进一步支持了化合物 5 的实际应用潜力。该研究为基于肽的药物 - 靶点设计提供了有益指导。

**研究背景与意义**
近年来，多肽药物在疾病治疗和健康领域发展迅速。其中，环肽化合物因其构象稳定，在癌症治疗中具有重要潜力。然而，天然环肽存在产量低的问题，且其结构修饰以改善理化性质的研究正受到越来越多的关注。目前的挑战在于，传统的环化方法限制了环肽的高效合成与结构修饰，且肿瘤微环境中丰富的肽酶和蛋白酶能迅速水解含天然 L-氨基酸残基的环肽，导致其体内失活。相比之下，D-氨基酸不仅能逃避水解，还可能优化环肽与肿瘤靶点疏水活性口袋的结合。此外，Yoon 等人开发的分子内光诱导单电子转移（SET）环化反应，利用邻苯二甲酰亚胺作为电子受体，末端含三甲基硅基（TMS）的肽链作为电子供体，在光激发下快速构建“供体 - 受体”系统，不仅能实现绿色快速环化，还能引入具有抗肿瘤活性的异吲哚啉酮结构，显著增强结构刚性。基于此，研究人员旨在通过改变亮氨酸（Leu）残基的构型，设计并合成一系列 Sansalvamide A（San A）类似物，评估其抗肿瘤活性，预测潜在靶点，并通过分子对接和计算机辅助 ADMET 分析深入探讨其作用机制及成药性。该研究成果发表于《RSC Advances》。

**主要研究方法**
研究人员首先通过化学合成法制备了具有分子内电子“供体 - 受体”系统的线性前体肽（化合物 1a–5a），利用 EEDQ 活化羧基并引入含 TMS 的构建模块，最后在 N 端引入邻苯二甲酰甘氨酸作为电子受体。随后，在自建光反应器中，以 450 W 中压汞灯为光源（300–400 nm），在氮气保护下的甲醇溶液中进行光诱导 SET 环化反应，合成目标环肽（化合物 1–5）。研究采用 MTT 法评估了化合物对肝癌（HepG-2）、乳腺癌（4T1）、结肠癌（CT26）细胞及正常成纤维细胞（L929，源自哈尔滨医科大学）的抑制活性。利用 SWISS 数据库预测靶点，结合 GeneCards 癌症基因库筛选重叠靶点，通过 STRING 数据库和 Cytoscape 软件构建蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）网络。进一步利用 DAVID 数据库进行基因本体（GO）和 KEGG 通路富集分析。通过分子对接技术计算化合物与关键靶点的结合能及相互作用模式。最后，利用 JC-1 探针检测线粒体膜电位变化，并通过 ADMETlab 3.0 平台进行计算机辅助药代动力学及毒性预测。

**研究结果**
**2.1 合成**
研究人员成功合成了目标线性肽（1a–5a）和环肽（1–5）。通过核磁共振（¹H NMR、¹³C NMR）和质谱对产物进行了表征。结果表明，光诱导 SET 反应能高效地将异吲哚啉酮结构引入环肽骨架，实现了 San A 类似物的绿色合成。

**2.2 体外抗肿瘤活性**
MTT assay 结果显示，与线性肽相比，环肽对三种肿瘤细胞系表现出显著的增殖抑制作用，且对正常 L929 细胞无明显毒性。其中，含多个 D-亮氨酸修饰的化合物 5 活性最强。这表明改变 Leu 残基构型可通过调节整体空间构象和优化侧链疏水取向双重途径，提高化合物与靶蛋白的结合效率和特异性。

**2.3 PPI 网络分析**
通过 PPI 网络分析，研究人员从 60 个癌症相关重叠靶点中识别出 6 个核心枢纽靶点：BCL2、MMP9、CTSB、CTSS、BCL2L1 和 MMP2。其中 BCL2 的 Degree 值最高，提示其为关键作用靶点。

**2.4 GO 和 KEGG 通路富集分析**
GO 分析表明，预测靶点主要富集于细胞凋亡过程、BAD-BCL-2 复合物形成等通路；KEGG 分析显示相关基因富集于凋亡、Notch 信号通路、癌症通路、p53 信号通路等。这提示化合物 1–5 可能通过调控这些通路发挥抗肿瘤作用。

**2.5 分子对接分析**
分子对接结果显示，环肽与 BCL2 的结合能力优于线性肽。化合物 5 与 BCL2 的对接得分为?10.8 kcal mol^?1，表明结合力极强。相互作用分析表明，化合物 5 通过常规氢键（与 Ser26、Arg297 残基）以及多种疏水相互作用（包括烷基、π-阳离子和π-σ相互作用，涉及 Arg、Trp、Met、Pro、Tyr 等残基）稳定地结合在 BCL2 的疏水口袋中。

**2.6 JC-1 检测 MMP 变化**
JC-1 实验显示，经化合物 5 处理后，4T1 细胞内的红色荧光（高 MMP）显著减弱，绿色荧光（低 MMP）增强，且呈浓度依赖性。这证实化合物 5 能通过靶向 BCL2 破坏线粒体膜电位，进而诱导肿瘤细胞凋亡。

**2.7 计算机辅助 ADMET 研究**
ADMET 预测表明，尽管化合物 5 分子量较大且违反 Lipinski 五规则，口服吸收可能受限，但其脂溶性（log P）和水溶性（log S）适宜，符合 Pfizer 成药性标准。该化合物血脑屏障透过率低，中枢神经副作用风险小。代谢方面，它是 CYP2C19 的底物并抑制 CYP3A4，具有联合用药潜力。其半衰期适中（1.208 h），且致癌性、血液毒性和肝毒性风险极低，具备良好的安全性基础。

**结论与讨论**
综上所述，本研究成功利用 D-亮氨酸构型修饰结合绿色光诱导 SET 环化策略，合成了一系列 Sansalvamide A 类似物。其中，化合物 5 展现出优异的体外抗肿瘤活性和低毒性。通过网络药理学分析确定 BCL2 为其关键靶点，分子对接和 JC-1 实验进一步证实化合物 5 能通过多重相互作用高亲和力结合 BCL2，降低线粒体膜电位，从而诱导肿瘤细胞凋亡。计算机辅助 ADMET 预测也支持其良好的成药性和安全性。该研究不仅设计合成了一种有前景的抗癌候选药物，也为基于环肽的药物设计提供了重要的理论依据和实践指导。