发现含硫代内酯基团的1,2,3-三唑连接甘氨酸酯与丙酸酯衍生物作为铜绿假单胞菌群体感应抑制剂：设计、合成、生物评价及生物膜抑制研究

《RSC Advances》：Discovery of triazole-tethered glycinate and propanoate derivatives bearing a thiolactone moiety as quorum sensing inhibitors of Pseudomonas aeruginosa: design, synthesis, biological evaluation, and biofilm inhibition

　　

群体感应（Quorum Sensing, QS）是细菌通过信号分子调控生物膜形成、毒力因子表达及耐药性的细胞间通讯机制，抗生素滥用加速了耐药病原菌的出现，亟需开发替代传统抗菌策略的抗毒力疗法。针对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS通路中的关键转录调节因子LasR，研究人员设计、合成了两类共30个甘氨酸酯与丙酸酯衍生物，通过分子对接、MM-GBSA（Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area）结合自由能计算筛选化合物，采用MH602荧光报告菌株评估其对LasR介导的QS抑制活性，浓度范围为250至8 μM。结果显示，化合物在250 μM时抑制率为79%–35%，8 μM时仍保留中等至较低活性（28%–7%）；构效关系（Structure-Activity Relationship, SAR）研究表明，三唑环上连有吸电子苯基取代基可增强活性，其中含3-硝基苯基的化合物11b与10o抑制效果最优。计算机模拟ADME（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion）预测与100 ns分子动力学模拟均支持其与LasR的稳定结合。进一步评价显示，活性最优化合物无显著细胞毒性，可有效抑制生物膜形成，并显著降低绿脓菌素（pyocyanin）与蛋白酶的产生，其中化合物10o表现最为突出，证实该类硫代内酯-三唑杂合分子是具有潜力的QS抑制剂，为应对细菌耐药性提供了新策略。

论文解读：《发现含硫代内酯基团的1,2,3-三唑连接甘氨酸酯与丙酸酯衍生物作为铜绿假单胞菌群体感应抑制剂》

研究背景与意义

抗生素的发现彻底改变了细菌感染的治疗格局，但其过度使用导致抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）成为全球公共卫生重大威胁。据健康指标与评估研究所（Institute for Health Metrics and Evaluation, IHME）统计，AMR每年导致约114万人死亡，现有指南依赖碳青霉烯类等最后防线抗生素，存在成本高、住院时间长及严重副作用等问题。群体感应（Quorum Sensing, QS）是革兰阴性菌通过N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones, AHLs）及其受体调控基因表达、毒力与生物膜形成的通讯机制，已成为抗毒力治疗的重要靶点。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为典型病原体，其LasI/R和RhlI/R双QS调控子通过AHLs（如3-氧代-C12-HSL和C4-HSL）控制毒力，靶向LasR可阻断细菌通讯与致病性，且不诱导选择性压力，是克服耐药性的创新策略。本研究由Kondapalli Venkata Gowri Chandra Sekhar团队完成，发表于《RSC Advances》。

主要技术方法

研究人员以铜绿假单胞菌LasR配体结合域（PDB ID: 2UV0）为靶点，采用Schr?dinger软件包进行分子对接与MM-GBSA结合自由能计算，通过再对接验证协议可靠性；设计合成两类共30个目标化合物，经¹H NMR、¹³C NMR、IR及HRMS确证结构；采用MH602 LasB荧光报告菌株（P_lasB: gfp (ASV)）评估QS抑制活性，浓度梯度为8–250 μM；通过SwissADME服务器预测ADME性质；对优选化合物开展100 ns分子动力学模拟分析结合稳定性；采用结晶紫染色法评价亚抑菌浓度下的生物膜抑制活性，检测绿脓菌素与蛋白酶水平变化；以人胚肾细胞系HEK293T评价细胞毒性。

研究结果

分子对接与MM-GBSA分析

再对接实验RMSD为1.2809 ?，验证了Glide模块可靠性。设计的化合物对接得分介于?8.521至?3.975 kcal mol^?1，MM-GBSA结合自由能介于?103至?58 kcal mol^?1，其中化合物11e、10g、11f、10o对接得分≤?7.9 kcal mol^?1，结合能约?88至?103 kcal mol^?1。多数活性化合物与LasR活性位点残基的相互作用模式与天然配体一致，化合物11c因结合亲和力低被选作阴性对照。

化学合成

以炔丙醇为起始原料，经酯化、亲核取代及Cu催化点击化学反应，构建两类硫代内酯-三唑杂合分子：系列I为甘氨酸酯衍生物（10a–p），系列II为丙酸酯衍生物（11a–n），总产率50%–80%，所有化合物经光谱数据确证结构。

LasR QS抑制活性

30个化合物在250 μM时均表现出显著抑制活性（34.75%–79.32%），随浓度降低活性递减；含3-硝基苯基的10o（77.29%）与11b（79.32%）在250 μM时活性最优，且10o在8 μM时仍保留6.75%抑制率。

构效关系（SAR）

电子吸电子取代基（如硝基、三氟甲基、卤素）普遍增强活性，丙酸酯系列（系列II）整体略优于甘氨酸酯系列（系列I）；3-硝基苯基取代的10o与11b为活性最优骨架；疏水性适中（log P 0.4–2.8）、分子量350–470 Da的化合物符合Lipinski规则，但较高极性表面积（TPSA 110–166 ?²）可能限制低浓度下的膜通透性。

ADME性质

所有化合物均满足Lipinski规则五，口服生物利用度评分0.55，无血脑屏障穿透性，胃肠道吸收多为高吸收，解释了高浓度活性显著、低浓度活性下降的现象。

分子动力学模拟

100 ns模拟显示蛋白RMSD稳定在1.8–2.6 ?，化合物10o、11b、11k的配体RMSD<4.0 ?，结合稳定；关键氢键与π-π相互作用集中于Trp60、Asp73、Arg61等保守残基，硝基与羰基等极性基团促进氢键形成，增强结合稳定性。

抗菌与生物膜抑制

优选化合物在≤125 μM时无生长抑制作用，亚抑菌浓度下仅10o显著抑制生物膜形成（p<0.0001），其余化合物未表现出明显效应，表明QS抑制不一定直接转化为表型抑制，可能与铜绿假单胞菌Las、Rhl、PQS多层级QS网络冗余有关。

毒力因子抑制

10o同时降低绿脓菌素水平，11b与11k显著抑制蛋白酶活性，证实该类化合物可选择性调控不同毒力通路。

细胞毒性

优选化合物对HEK293T细胞的IC₅₀为165–193 μM，显示良好的安全性窗口。

讨论与结论

本研究首次报道硫代内酯-三唑杂合骨架作为新型QS抑制剂化学型，通过分子杂交策略平衡了AHL类似物的稳定性与三唑的生物电子等排优势。尽管整体活性弱于阳性对照Furanone C-30，但构效关系明确：三唑环引入吸电子基团可增强与LasR关键残基的相互作用，丙酸酯 linker 较甘氨酸酯更利于活性维持。研究证实该类化合物通过选择性抑制LasR通路，在不影响细菌生长的前提下降低生物膜与毒力因子产生，可作为抗生素佐剂开发，为应对AMR提供了结构新颖的先导化合物。未来研究可通过优化极性表面积改善膜通透性，进一步提升体内外活性。