《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Strategic biorefinery approach for closing the loop in the sugar industry: Valorisation of exhausted pulp into PHB via integrated bioconversion and kinetic modelling
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循环生物经济的转型需要将农工残余生物质转化为高价值生物制品。本研究探讨了一种集成方法，利用废糖用甜菜粕（exhausted sugar beet pulp, ESBP）作为可持续原料生产聚-β-羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）。首
循环生物经济的转型需要将农工残余生物质转化为高价值生物制品。本研究探讨了一种集成方法，利用废糖用甜菜粕（exhausted sugar beet pulp, ESBP）作为可持续原料生产聚-β-羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）。首先，ESBP经高温暗发酵（thermophilic dark fermentation）处理，获得富含挥发性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）的出水（15.1 g/L），其中乙酸和丁酸占主导。随后，评估了碳氮比（carbon-to-nitrogen ratio, C/N）（44、35和20）对产碱杆菌（Cupriavidus necator）合成PHB的影响。实验结果表明，原出水（C/N 44）触发了最高的比聚合物积累量（占细胞干重的77.5%）。为深入理解生物转化动力学，研究人员开发并验证了解聚动力学模型（unlumped kinetic model）（R2 > 0.95），有效解耦了残留生物质生长与PHB积累。该模型通过引入胞内降解项，成功识别了关键收获时间，从而防止底物限制条件下的产物损失。对于C/N比为44和35的条件，最大体积产率在0.063–0.066 g·L?1·h?1范围内，最佳收获时间在48.2–49.1 h范围内，此时PHB积累量为65.3–65.65%。这些发现表明，未经补充的甜菜粕发酵可能是一种经济高效且可持续生产生物塑料的方法。
塑料材料因其多功能性、低成本和耐久性而成为现代工业不可或缺的组成部分；然而，其大规模生产及低生物可降解性已引发全球性环境危机，影响生态系统和人类健康。为应对此挑战，科学研究正聚焦于开发可持续技术，从先进的回收工艺到生产可替代传统聚合物的生物降解生物塑料。在此背景下，从线性"获取-制造-处置"模式向循环生物经济的转型，使农工残余物的价值化成为现代生物炼制的基石。
废糖用甜菜粕（ESBP）是制糖工业中一种重要的有机废物流，即蔗糖提取后的残留物，其特征为富含可发酵碳水化合物，如果胶、半纤维素和纤维素，使其成为转化高附加值产品的理想原料。将ESBP整合到生物炼制框架中，不仅可缓解其处置带来的环境影响，还为第一代原料提供了可持续替代方案，从而避免与粮食安全产生竞争。
暗发酵（dark fermentation, DF）是实现此类复杂生物质价值化的有前景途径。该生物过程可实现能量和化学品的同步回收：以氢气（H?）作为清洁能源载体，以及富含挥发性脂肪酸（VFAs）的液体出水。这些VFAs，主要是乙酸和丁酸，构成了所谓的"羧酸盐平台"（carboxylate platform），作为多种生物技术应用的通用构建模块，包括生物塑料的合成。
聚-β-羟基丁酸酯（PHB）作为聚羟基链烷酸酯（polyhydroxyalkanoates, PHAs）家族中最突出的成员，因其完全生物可降解性和热塑性而成为一种可持续的石油基塑料替代品。产碱杆菌（Cupriavidus necator）仍是PHB生产的模式微生物，因其能有效同化VFAs并积累高浓度胞内聚合物。然而，从微生物生长到PHB储存的代谢转变严格受营养可利用性调控，特别是碳氮比（C/N）。氮是蛋白质合成和细胞复制所必需的，但在碳过量条件下的氮限制是触发PHB积累的主要因素。因此，优化该比例对于最大化聚合物产率和产率至关重要。尽管如此，现有文献显示该参数最优值存在显著变异性。
为确保该过程的可扩展性和经济可行性，需要深入理解生物转化动力学。PHB生产动力学的数学建模为描述底物消耗、生物质生长和聚合物积累之间的复杂相互作用提供了有力工具。通过实施动力学模型，可以预测不同营养条件下的系统行为、优化补料策略，并减少过程强化所需的实验工作量。
本研究的主要目标是评估利用ESBP暗发酵所得出水、由C. necator生产PHB的可行性。该研究具体调查了C/N比对微生物生长、VFA消耗动力学和聚合物积累效率的影响，将原出水与氮补充培养基进行比较。与以往经常使用合成混合物或集总模型的研究不同，本研究调查了原始ESBP衍生出水的直接使用以降低成本，并提出了一种新型解聚动力学模型，将残留生物质生长与PHB积累解耦，从而能够精确识别"最佳收获时间"以防止底物限制条件下的聚合物动员。
该研究使用的关键技术方法主要包括：样本方面，ESBP由AB Azucarera Iberia SLU（西班牙马德里）提供；暗发酵在5 L不锈钢半连续搅拌釜反应器（semi-continuous stirred tank reactor, SSTR）中进行，采用先前驯化至ESBP的嗜热微生物群落，在嗜热条件（55 °C）、水力停留时间（hydraulic retention time, HRT）为5天的条件下运行；发酵出水经多阶段分离（沉降、4500 rpm离心15 min、真空过滤）后，通过气相色谱法（配备FID检测器和NukolTM毛细管柱）分析VFAs；PHB通过酸性甲醇解后气相色谱法定量，使用CPSIL-5CB柱，以聚（3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯）为标准品；生物量和PHB积累分别通过重量法和气相色谱法测定；动力学建模方面，采用Logistic方程描述生物质演化，Pirt模型分配底物消耗用于生长和维持需求，修正的Luedeking–Piret公式描述产物形成，并引入胞内降解项，通过MATLAB R2023b中的ODE45求解常微分方程组，采用Levenberg-Marquardt算法进行非线性最小二乘参数估计。
研究结果部分：
3.1 废糖用甜菜粕的暗发酵
ESBP的化学组成分析显示，最大组分为蛋白质、果胶和可溶性多糖（47.69%），其中42.19%为易释放组分（非盐提取物），5.50%为可溶性盐。结构组分包括纤维素（21.4%）、可忽略的不溶性酸木质素（0.15%）以及半纤维素（25.26%），使ESBP成为暗发酵等生物技术过程的适宜底物。
系统在57 g pulp·day?1（8% w/w）的进料速率下运行时，部分碳被分流至气相（H?和CO?），氢气产率稳定在1.17 ± 0.20 L H?·day?1，比产率为20.5 mL H?·g?1干重（DW）。稳定的H?产生表明酸原代谢途径的一致性。液体出水中剩余有机碳（VFAs）随后用于PHB合成。
出水分析显示COD值为17,461 ± 185 mg O?·L?1，TOC为7,164 ± 56 mg·L?1，该COD值显著超出文献报道的制糖工业废弃物范围（100–12,211 mg O?·L?1），证实ESBP暗发酵产生了极高碳密度的出水。C/N比为44（源自TN浓度159 ± 13 mg·L?1），处于有利于诱导聚合物积累的范围。总VFA浓度为15,102 ± 1,579 mg·L?1（以乙酸当量计），组成为：乙酸（8.96 g·L?1）、丁酸（4.37 g·L?1）、己酸（1.16 g·L?1）和丙酸（0.42 g·L?1），VFA分布以C?至C?酸为特征，尤其富含乙酸和丁酸，有利于生物技术转化。
3.2 碳氮比对聚-β-羟基丁酸酯生产的影响
研究人员采用三种不同C/N比（44、35和20）进行批次实验评估。C/N 44对应ESBP暗发酵后的原出水，C/N 35和20通过添加硫酸铵提高氮含量获得。
微生物生长方面，各C/N比实验的微生物浓度稳定在4.8–5.3 g·L?1范围内，但达到最大值的时间不同。C/N 44在培养62 h后达到最大生物量，而其他C/N比在45–48 h内更快达到最大。最终生物量浓度的相似性表明，虽然氮可利用性调节生长速率，但最大生物质生长（X
max）最终受出水中总碳浓度限制。
PHB生物合成方面，所有实验条件下积累的生物聚合物均鉴定为聚-3-羟基丁酸酯（PHB）。生产动力学呈现一致特征：约20 h的初始延滞期，随后快速积累期在不同氮含量条件下于不同时间点达到峰值。C/N 44在72 h后达到最高PHB浓度（4.3 g·L?1）；C/N 35在60 h后达3.8 g·L?1；C/N 20在54 h后达3.3 g·L?1。C/N 44的优越性表明，未经氮补充的原出水高度有利于PHB积累，消除了外部氮补充的需求，这与文献报道的35–50范围一致。
关于VFA消耗特征，VFA摄取速率与氮可利用性直接成正比，较低C/N比下观察到更快的消耗。C/N 20条件下，大部分VFAs在54 h内耗尽；而C/N 35和44分别需要60 h和72 h才能达到类似耗尽水平。所有情况下均实现了100% VFA去除，突显C. necator利用甜菜粕衍生复杂出水的有效性。底物偏好方面，观察到明显的顺序消耗模式：C. necator对偶数链脂肪酸表现出明显偏好，丁酸和己酸在培养前24–30 h优先被同化；乙酸消耗较缓慢，持续作为主要碳源至发酵后期；丙酸消耗较偶数链VFAs存在明显延滞，在前12–18 h保持相对稳定，后期与乙酸共代谢。
生长、底物耗尽与产率的相关性方面，VFA耗尽与PHB峰值之间存在强相关性，但碳通量在催化生物量增长、细胞维持和生物聚合物储存之间分配。C/N 44在72 h达到最大PHB，恰为残留乙酸完全耗尽之时；C/N 35在60 h达到峰值，恰为VFA池完全耗尽之时；C/N 20在54 h达到最大聚合物积累，亦恰为碳源耗尽之时。此后所有实验均观察到PHB浓度下降，因C. necator开始动员胞内PHB作为内源碳和能量源用于维持。
表观产率因子计算显示，生物量/底物产率（Y'
X/S）在0.382–0.466 g biomass·g?1 substrate范围内，C/N 35时最大（0.466 g·g?1）。产物/底物产率（Y'
P/S）对于原出水（C/N 44）为0.337 g·g?1，较C/N 35和C/N 20分别高0.9%和30.6%。产物/生物量产率（Y'
P/X）显示对C/N比的明显依赖性，C/N 44时（0.852 g·g?1）较C/N 35高18.6%，较C/N 20高26.4%。
3.3 PHB生产过程的动力学建模
本研究采用解聚方法，将残留生物质（X）的动力学与聚羟基链烷酸酯（P）积累解耦，区别于文献中常将微生物培养物视为单一集总生物质变量的处理。该解耦框架允许实施特异性作用于底物匮乏期间聚合物组分的动员项k
deg，在集总表述中将数学上被掩盖的现象得以表征。
模型参数估计方面，表2所列八个动力学参数的回归系数（R2）均超过0.95。最大比生长速率（μ
max）为0.10–0.16 h?1，维持系数（m
S）约0.01 h?1，均处于C. necator在VFAs上生长的预期生理范围。生长关联产物合成系数α在C/N 44时为0.222 g·g?1，表示PHB合成部分发生在指数生长期；而C/N 35和20时α趋于零，表明转向严格的非生长关联合成机制（β在0.023–0.040 h?1范围）。
过程产率与工业最优收获时间方面，模型识别C/N 44和C/N 35为最具生产效益的体系，Q
p-max为0.063–0.066 g·L?1·h?1。t
opt-Qp值在48.2 h（C/N 44）至55.1 h（C/N 20）范围内。最大体积产率时的PHB百分比（% PHB
t-opt）在三组实验中几乎相同（65.2–65.5%），表明其独立于C/N比。绝对最大PHB含量为C/N 44时77.5%，达到该最大值的时间为69.1 h，但此时Q
p较低（0.053 g·L?1·h?1）。
4. 结论
本研究证明了以ESBP为主要原料、通过集成生物炼制途径生产PHB的可行性。ESBP的高温暗发酵产生了富含VFA的出水（15.1 g·L?1），可作为C. necator的稳健原料。原出水的营养组成（C/N比44）对生物聚合物储存高度有利，无需氮补充即可达到77.5%细胞干重的最大比积累量。不同C/N比的调查揭示，C/N 44和C/N 35提供了最佳代谢平衡，最大化了体积产率和全局底物转化效率。解聚动力学模型的实施被证明是优化该生物过程的强有力工具，以高统计可靠性（R2 > 0.95）有效解耦了残留生物质生长与PHB合成。特别是，胞内降解项的引入使得能够识别关键最优收获时间。该模型驱动的方法通过预测底物耗尽的确切时刻并防止储存聚合物的代谢动员，确保了最大产物回收率。总之，通过该集成生物平台对ESBP进行价值化，为生产生物塑料提供了一种经济有效且可持续的策略，显著促进了循环生物经济目标的实现。
