《Discover Public Health》：Historical evolution and molecular mechanisms of antimalarial drug resistance with emerging challenges and future directions
疟疾仍然是全球重大公共卫生问题，尤其在低收入和中等收入国家，持续造成显著的发病和死亡负担。抗疟药物疗效的持续维持是疟疾控制与消除工作的核心。然而，抗疟药物耐药性的出现与传播，尤其是在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中，已对疾病控制所取得的成效构成严重威胁。本叙述性综述综合了关于抗疟药物历史演化、耐药性潜在分子机制、新发耐药挑战及耐药遏制未来方向的现有证据。综述追溯了抗疟治疗药物从早期喹啉类化合物到现代青蒿素联合疗法（ACTs）的发展历程，并强调药物选择压力如何驱动耐药寄生虫株的筛选。研究重点关注已得到充分表征的分子耐药标志物，包括Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps及kelch13基因。文中详细讨论了这些遗传改变降低寄生虫对抗疟药物敏感性的机制。此外，综述评估了当前策略，并提出遏制耐药传播的未来路径，包括加强分子监测、优化药物使用、整合媒介控制以及加大新型治疗手段研发投入。总体而言，该综合分析强调，亟需开展协调一致的全球行动，以监测、理解并应对抗疟药物耐药性。
1 Introduction
本文首先从全球公共卫生视角界定疟疾负担及其持续性影响，指出疟疾作为重要媒介传播性传染病，仍在低收入和中等收入国家，尤其是撒哈拉以南非洲，造成显著发病率与死亡率。正文概述了疟原虫属感染人类的5种主要虫种，并强调恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）与间日疟原虫（P. vivax）是全球疾病负担的主要来源，其中恶性疟原虫毒力最强、与死亡最密切相关。随后，文章总结了近年来疟疾防控的关键进展，包括杀虫剂处理蚊帐（ITNs）、室内滞留喷洒（IRS）、化学预防、快速诊断检测（RDTs）和青蒿素联合疗法（ACTs）的推广，并指出高效抗疟药物仍是控制和消除疟疾的基础。与此同时，恶性疟原虫对几乎所有主要抗疟药类别产生耐药，已成为全球消除疟疾进程中的关键障碍。
该部分还特别讨论了南亚，尤其是印度，在全球抗疟药耐药格局中的重要但常被低估的地位。文章指出，印度存在恶性疟原虫与间日疟原虫共流行的复杂流行病学背景，且多个邦已检出Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps和Pkelch13相关多态性。东北部地区呈现与东南亚相似的耐药谱，提示跨境寄生虫流动及共同用药史的影响；而中部和西部地区耐药频率相对较低，反映不同药物选择压力。作者进一步指出，抗疟药物使用模式、寄生虫遗传多样性、变异率、耐药适应代价、治疗依从性和药物压力强度共同塑造了耐药的出现与传播。最后，本节明确综述目的，即系统整合抗疟药物耐药的历史演化、分子基础、青蒿素耐药新挑战及其对疟疾控制的影响。
2 Methodology
本文采用叙述性综述方法，并说明研究过程遵循叙述性综述文献评价量表（SANRA），以保证方法学透明性、清晰性与科学严谨性。在文献检索方面，研究人员于PubMed、Scopus和Google Scholar三大数据库中检索1990年至2025年间发表的同行评议文献，采用医学主题词（MeSH）及自由词结合布尔逻辑进行系统检索，关键词覆盖疟疾、恶性疟原虫、氯喹耐药、磺胺多辛-乙胺嘧啶耐药、青蒿素耐药、Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps、Pfk13、kelch13、分子标志物、治疗失败及耐药流行率等核心主题。
在研究筛选方面，文章描述了由两名审阅者独立完成题目和摘要初筛，再进行全文资格审查的两阶段流程。纳入研究包括原始研究、系统综述和叙述性综述，要求内容涉及抗疟药耐药历史、机制、分子标志物或公共卫生影响，并包含流行率数据、治疗结局数据、分子分型或表型耐药分析。排除标准包括方法学描述不清、重复发表、非英文、缺乏全文的会议摘要及与主题无关研究。研究分歧通过共识或第三位审阅者裁决。最终纳入131篇文献，构成全文综述证据基础。
3 Historical perspective: from quinolines to artemisinins
3.1 Early antimalarial drugs resistance
3.1.1 Quinine
本小节回顾奎宁（quinine）作为最早被西方医学正式认可的特异性抗疟药物的历史起源。作者指出，奎宁源于金鸡纳树皮，其药用实践最初见于南美安第斯地区。随着金鸡纳树皮于17世纪传入欧洲，其抗疟疗效逐渐获得广泛认可。1820年，研究者成功从树皮中分离出奎宁和辛可宁两种活性生物碱，从而推动奎宁成为长期主导性的抗疟治疗药物。随后，二战期间原料供应受阻以及寄生虫对奎宁逐步产生耐受，促使全球开始探索替代性抗疟化疗药物，这构成后续药物研发的重要历史转折点。
3.1.2 Chloroquine
该部分指出，氯喹（CQ）于1934年被发现，作为针对红细胞期疟原虫的高效药物，在20世纪中后期极大降低了疟疾相关发病率和死亡率。氯喹因安全性高、耐受性好、价格低廉且疗效广谱而被广泛使用。然而，自1957年泰柬边境首次报告恶性疟原虫氯喹耐药后，耐药株迅速向东南亚、南美、亚洲及大洋洲扩散，并于20世纪70年代末进入非洲。文章强调，氯喹耐药的蔓延显著削弱了全球疟疾控制成果，并对世界卫生组织（WHO）早期疟疾根除规划造成重大冲击。
3.1.3 Mefloquine and halofantrine
本节介绍甲氟喹（mefloquine）和哈洛芬特林（halofantrine）作为喹啉甲醇类合成抗疟药的开发背景。二者由美国陆军在越南战争时期为应对氯喹耐药疟疾而重新筛选候选化合物后获得。尽管两药相继获批上市，但临床使用后迅速暴露出严重安全性问题：哈洛芬特林可致致命性心律失常，甲氟喹与神经毒性及严重精神不良事件相关。因此，这两种药物在许多国家被撤出常规治疗方案，反映出抗疟药开发不仅受耐药驱动，也受药物安全性强烈制约。
3.1.4 Antifolates
作者进一步梳理抗叶酸类药物的发展过程。乙胺嘧啶（pyrimethamine）与磺胺多辛（sulfadoxine）通过抑制叶酸生物合成通路中的二氢叶酸还原酶和二氢蝶酸合酶，提供了不同于氯喹的作用机制。由于单药治疗耐药发展迅速，随后形成磺胺多辛-乙胺嘧啶（SP）联合方案。尽管SP一度成为氯喹耐药背景下的重要替代治疗，但其广泛使用最终导致恶性疟原虫耐药普遍化及治疗失败率升高。目前SP虽在治疗中受限，但仍用于孕妇间歇性预防治疗（IPTp）和婴幼儿间歇性预防治疗（IPTi）等特定防控场景。
3.2 Emerging antimalarial drug resistance
3.2.1 Artemisinin
本节概述青蒿素（artemisinin）及其衍生物的发现与应用。1972年，屠呦呦团队从黄花蒿中成功分离青蒿素，标志着抗疟治疗的重要突破。随着既往药物耐药的持续扩大，WHO推荐青蒿素联合疗法（ACTs）作为无并发症疟疾的一线治疗方案，并被多个国家迅速采纳。文章同时指出，青蒿素敏感性下降最早见于柬埔寨等东南亚地区，随后在撒哈拉以南非洲亦逐渐出现，且与Kelch13基因突变密切相关，提示ACTs的长期有效性正面临严峻挑战。
4 Molecular marker and mechanism of antimalarial resistance
4.1 P. falciparum chloroquine resistance (Pfcrt) phenotype
本节指出，Pfcrt是氯喹耐药研究中最核心的分子决定因子之一。20世纪90年代的遗传连锁研究将耐药位点定位于7号染色体36 kb区段，并最终识别出恶性疟原虫氯喹耐药转运体基因Pfcrt。文章强调，K76T突变是临床氯喹耐药（CQR）的关键分子标志，同时还存在其他补偿性突变参与耐药表型塑造。
4.2 Structure of P. falciparum chloroquine resistance (Pfcrt) transporter
作者系统描述了Pfcrt蛋白的结构特征。Pfcrt定位于寄生虫消化液泡（DV）膜，属于药物/代谢物转运体（DMT）超家族，为由13个外显子编码的424个氨基酸跨膜蛋白，具有10个α螺旋跨膜区（TMDs）。这些跨膜区共同形成底物转运通道，影响氯喹等药物在液泡内的蓄积与药效学表现。Pfcrt不依赖三磷酸腺苷（ATP）驱动转运，其结构基础决定了其在药物外排及耐药形成中的功能。
4.3 Mechanism of P. falciparum chloroquine resistance (Pfcrt)
本部分围绕氯喹作用机制及Pfcrt介导的耐药机制展开。氯喹作为弱二元碱，在中性状态下扩散进入酸性消化液泡后被质子化并滞留，从而高浓度结合游离血红素，抑制其聚合为疟色素（haemozoin），最终形成细胞毒性复合物并杀伤寄生虫。Pfcrt的K76T突变改变转运体构象，使质子化氯喹更易被外排或更难在液泡中保留，导致药物液泡内浓度下降、血红素解毒持续进行，寄生虫因此存活。
4.4 P. falciparum multidrug resistance 1 (Pfmdr1) gene
该节介绍Pfmdr1基因的基本性质。Pfmdr1位于5号染色体，编码P-糖蛋白同源物1，属于ATP结合盒（ABC）转运体超家族。其产物为1419个氨基酸的跨膜糖蛋白，具有典型的两个核苷酸结合域（NBDs）和多个跨膜螺旋结构。Pfmdr1被视为影响寄生虫药物适应性与多药反应的重要调节分子。
4.5 Structure and cellular localization of Pfmdr1 ABC transporter proteins
作者进一步总结Pfmdr1蛋白结构与定位。Pfmdr1主要分布于消化液泡膜，少量存在于寄生虫质膜，作为ATP依赖性转运系统，可跨膜转运氨基酸、代谢物、离子、脂质、毒素及多种抗疟药。其两个跨膜域（TMDs）构成底物转运通路，两个核苷酸结合域（NBDs）负责ATP结合与水解，通过构象变化驱动底物识别与定向转运。这一结构特征是其参与药物敏感性调控的基础。
4.6 Mechanism and functional role of Pfmdr1 in antimalarial drug response
本节强调，Pfmdr1通常并非单独决定耐药，而是通过与Pfcrt等标志物相互作用，调节多种药物在寄生虫内的转运效率与靶位可及性。研究中重点讨论了N86Y、Y184F、S1034C、N1042D和D1246Y等单核苷酸多态性（SNPs），这些变异可影响氯喹、阿莫地喹、甲氟喹、卢美芬特林和蒿甲醚类药物反应。此外，Pfmdr1拷贝数变异（CNVs）可导致蛋白过表达，并与奎宁、甲氟喹、卢美芬特林、哈洛芬特林和青蒿素（ART）反应变化相关。文章同时指出，其确切生物学机制仍未完全阐明。
4.7 P. falciparum dihydrofolate reductase (dhfr) and dihydropteroate synthase (dhps) resistance genes
本节概述SP耐药的核心基因基础，即Pfdhfr与Pfdhps。抗叶酸药通过抑制叶酸合成关键酶从而阻断DNA合成和寄生虫增殖，而这两基因中的突变可显著降低药物敏感性，并已深刻影响全球抗疟治疗政策。
4.8 Structure and mechanism of Pfdhfr resistance genes
作者指出，Pfdhfr位于4号染色体，是dhfr-ts双功能蛋白的一部分，包含N端dhfr结构域和C端胸苷酸合酶（ts）结构域。Pfdhfr活性位点与二氢叶酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）结合，催化四氢叶酸生成。乙胺嘧啶通过结合活性口袋抑制该酶，而N51I、C59R、S108N和I164L等点突变可改变结合口袋拓扑结构，降低药物亲和力，其中S108N是乙胺嘧啶耐药的关键决定因素，多重突变叠加则导致更高水平耐药。
4.9 Structure and mechanism of Pfdhps resistance genes
本小节说明Pfdhps位于8号染色体，是PPPK-DHPS双功能酶的一部分，参与对氨基苯甲酸（pABA）与二氢蝶啶焦磷酸的缩合反应。磺胺多辛作为pABA结构类似物，通过竞争性抑制DHPS阻断叶酸辅因子生成。A437G、K540E、A581G等突变可改变pABA结合裂隙构象，降低磺胺多辛结合能力。文章强调，Pfdhfr三重突变与Pfdhps双重突变形成的“五重突变体”是SP治疗失败的重要预测指标，而合并A581G的“六重突变体”进一步威胁IPTp-SP和季节性疟疾化学预防（SMC）的持续有效性。
5 Emerging challenges of antimalarial resistance
5.1 Spread of artemisinin resistance
本节指出，青蒿素耐药是当前抗疟药耐药最严重的新兴挑战。耐药最初发现于大湄公河次区域，近期分子监测则显示其已在卢旺达、乌干达和坦桑尼亚等撒哈拉以南非洲国家独立出现并局部传播。由于非洲承受全球最高疟疾负担，这一趋势可能导致发病率和死亡率显著回升。
5.2 Mechanism of artemisinin resistance and P. falciparum kelch13 (Pfk13) propeller mutations
该部分深入讨论青蒿素耐药的分子机制。青蒿素通过与血红素铁反应生成活性氧（ROS）及碳中心自由基而杀伤寄生虫。Pfk13突变可减少早环状体阶段的血红蛋白胞吞，降低药物活化所需游离血红素水平；同时，寄生虫可增强抗氧化能力、未折叠蛋白反应（UPR）及损伤修复能力，并在药物暴露期进入休眠或生长迟缓状态，从而表现为部分耐药和寄生虫清除延迟。文中列举了F446I、N458Y、M476I、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、P574L、C580Y和A675V等已确认与青蒿素部分耐药相关的K13桨叶结构域突变，其中C580Y在东南亚最具代表性。文章同时指出，这些变异也已在非洲及印度东北部报告，提示独立演化和跨境传播的双重风险。
5.3 Structure of P. falciparum kelch13 (Pfk13) propeller
作者进一步总结Pfk13蛋白结构。该基因位于13号染色体，编码726个氨基酸蛋白，包括疟原虫特异性N端区、卷曲螺旋结构域（CCC）、BTB结构域和C端Kelch重复桨叶结构域（KREP）。KREP结构域形成典型六叶β-桨叶折叠，是多数耐药相关突变聚集区域。C580Y、R539T、Y493H和A675V等突变多位于暴露环区或表面区域，可改变蛋白构象稳定性、电荷分布及蛋白互作界面，进而削弱内吞、泛素化及蛋白稳态相关通路，降低青蒿素暴露下的损伤程度并提高寄生虫存活能力。
6 Public health implications of antimalarial drug resistance
本节从公共卫生层面系统分析抗疟药耐药的后果。Pfcrt和Pfmdr1相关耐药已导致氯喹及相关药物治疗失败增加、感染迁延、传播增强及死亡风险升高；Pfdhfr和Pfdhps相关SP耐药则削弱孕妇和婴幼儿预防治疗效果，增加低出生体重等不良妊娠结局风险。更严重的是，Pfk13介导的青蒿素耐药直接威胁ACTs疗效，可造成寄生虫清除延迟、复燃及持续传播。文章还指出，多位点耐药标志物的并存增加了多药耐药株形成风险，并将对医疗成本、卫生系统负担、国家治疗指南更新及跨境输入传播带来深远影响。作者强调，分子监测必须与卫生系统强化、优质药物可及性和社区层面干预相结合，才能真正转化为疟疾负担下降。
7 Current strategies for addressing resistance
本节总结当前应对策略，包括加强分子监测与治疗疗效研究，以便及早发现耐药并指导政策调整；规范诊断与治疗流程，防止劣质药物流通和口服单药治疗，减少不必要药物压力；通过杀虫剂处理蚊帐和室内滞留喷洒等综合媒介控制手段降低传播强度；同时持续投资新型抗疟药研发，探索非青蒿素类新机制化合物及宿主导向治疗策略，以延缓现有药物失效。
8 Future direction
8.1 Strengthening genomic and molecular surveillance of antimalarial resistance
作者提出，未来抗疟耐药控制需依托连续、高分辨率的基因组与分子监测体系。下一代测序技术可用于耐药相关单倍型识别、传播网络重建及选择清除（selective sweeps）检测，并揭示复杂遗传背景下的多基因耐药表型。为实现研究成果向政策转化，还需建设区域数据共享网络、统一分析流程并持续提升分子流行病学能力。
8.2 Expanding the antimalarial drug pipeline and optimizing therapeutic strategies
本节强调长期治疗可持续性依赖多元化药物管线。随着ACTs伴侣药疗效下降，药物研发应聚焦蛋白稳态、线粒体代谢和表观遗传调控等新靶点。三联青蒿素联合疗法（TACTs）在多药耐药地区显示出潜在优势，但从长远看，仍需持续推进首创新药、长效制剂、阻断传播药物及宿主导向治疗的发展。
8.3 Implementation of effective vector control measures
该部分指出，降低传播强度能够减少寄生虫群体规模与遗传多样性，从而抑制耐药选择。综合媒介管理应结合杀虫剂处理蚊帐、室内滞留喷洒、孳生地管理及环境干预。面对按蚊杀虫剂耐药扩张，文章提出应发展双活性成分蚊帐、新靶点杀虫剂及生物防治技术，并关注将抗疟药整合至蚊媒干预工具中的新策略，以实现针对寄生虫而非仅针对媒介的传播阻断。
8.4 Strengthening health systems and ensuring rational antimalarial use
作者最后强调，耐药遏制的根本保障在于卫生系统能力建设。提高诊断覆盖率、保障药品供应链稳定、规范治疗实践、加强药物警戒以及持续培训医务人员，均可减少亚治疗暴露与不当用药所带来的选择压力。同时，社区参与和患者教育有助于提升依从性、减少药物滥用；国家疟疾控制项目则需根据基因组学和药理学新证据及时调整政策，并依赖持续政治承诺与长期资金投入维持干预成效。
9 Conclusion
结论部分指出，抗疟药耐药性仍是制约疟疾可持续控制与消除的最重要障碍之一。恶性疟原虫耐药的形成是药物压力与寄生虫适应性共同作用下的历史、分子与流行病学过程。Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps和Pfk13等关键基因突变已显著削弱多类一线抗疟药疗效，其中青蒿素部分耐药的出现与扩散尤具威胁性。文章最终呼吁，通过加强分子与基因组监测、促进合理用药、实施综合媒介控制并持续投入新药研发，形成协调一致的全球应对体系，以维持现有治疗手段有效性并推进全球疟疾消除目标。
