G蛋白βγ（Gβγ）亚基激活KV7和BKCa通道是肌源性大鼠冠状阻力动脉中降钙素基因相关肽（CGRP）血管舒张作用的基础

《British Journal of Pharmacology》：Gβγ subunit activation of KV7 and BKCa channels underlies calcitonin gene-related peptide vasorelaxation in myogenic rat coronary resistance arteries

　　

背景与目的：CGRP是一种强效的、具有临床相关性的冠状血管舒张剂，已知在心脏保护中发挥作用。在此，研究人员调查了导致小冠状动脉血管舒张的精确细胞内信号通路。 实验方法：本研究使用离体（ex vivo）肌动描记术和细胞内记录技术，研究了α-CGRP在肌源性活跃的离体大鼠冠状动脉中诱导的血管舒张和血管平滑肌细胞（VSMC）超极化。 关键结果：CGRP诱导的血管舒张不依赖于内皮，但在很大程度上依赖于K+通道的激活。免疫组织化学表明KV7和BKCa通道在VSMC和内皮细胞中均有表达。KV7通道抑制剂linopirdine和BKCa通道抑制剂paxilline的组合显著减弱了内皮完整或去内皮动脉中CGRP诱导的血管舒张。电生理学证实CGRP引起超极化，并且显示这被linopirdine和paxilline阻止，同时也证明了KV7和BKCa通道在抑制去极化平滑肌锋电位中的作用。这些锋电位也被NO•和HNO供体抑制，导致超极化。使用gallein抑制Gβγ亚基使内皮完整和去内皮冠状动脉中CGRP诱导的血管舒张曲线显著右移。 结论与启示：α-CGRP刺激冠状微血管中强烈的血管舒张，这依赖于涉及KV7和BKCa通道的Gβγ亚基激活的VSMC超极化。这些数据增进了对冠状微血管生理学的理解，并为设计针对冠状血管功能障碍的未来治疗策略提供了信息。

论文解读：Gβγ亚基介导CGRP诱导的冠状微动脉舒张机制

研究背景与意义

心脏需要根据心肌的代谢需求动态调整血液分布，这主要通过调节冠状动脉张力来实现，其中微血管发生的血管阻力变化最为显著。目前有证据表明，大多数心血管疾病中都存在这些小血管舒张能力受损的情况，因此明确血管舒张剂如何调节冠状血管阻力至关重要。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide, CGRP）是已知最强的内源性血管舒张剂之一，最早由Brain等人报道可引起微血管扩张。CGRP是一种由37个氨基酸组成的神经肽，主要通过选择性剪接CALCA/CALC1基因转录本产生α-CGRP亚型，在心血管系统中分布广泛。CGRP受体由G蛋白偶联受体（GPCR）——降钙素受体样受体（CLR）、受体活性修饰蛋白1（RAMP1）和受体组分蛋白组成。传统上认为CGRP受体与Gα_s偶联，通过激活cAMP-PKA通路引起血管舒张；但近期研究提示Gβγ亚基也可能参与其中，具体信号通路尚不清楚。此外，CGRP在心肌缺血、高血压和心力衰竭等疾病中具有心脏保护作用，也是偏头痛治疗的重要靶点。然而，关于CGRP在冠状微血管（尤其是具有肌源性张力的血管）中的精确信号通路仍缺乏研究，超极化与血管舒张同时检测的数据尤为缺乏。为此，研究人员利用离体（ex vivo）技术组合，探索了α-CGRP在大鼠肌源性收缩的室内膈冠状动脉（intramuscular coronary septal arteries）中引起血管舒张的细胞内信号机制。该研究发表在《British Journal of Pharmacology》。

主要关键技术方法

研究人员使用200–300 g的雄性Wistar Han和Wistar大鼠，分离直径为约150–350 μm的室内膈动脉（intraventricular septal artery）段。主要技术包括：离体线肌动描记术（wire myography）用于在肌源性张力基础上评估CGRP浓度依赖性血管舒张及药物干预效应；同步锐利微电极记录血管平滑肌细胞（VSMC）膜电位（E_m）与等长张力的电生理技术；免疫组织化学染色（免疫ohistochemistry）用于检测K_V7.4、K_V7.5、BK_Ca（K_Ca1.1）及内皮紧密连接蛋白ZO-1在血管中的表达与分布；使用特异性药理学工具（如CGRP受体拮抗剂BIBN 4096、K_V7抑制剂linopirdine、BK_Ca抑制剂paxilline、Gβγ抑制剂gallein、NOS抑制剂L-NAME、K_ATP抑制剂glibenclamide、NO供体SNAP和IPA-NO等）来解析信号通路。

研究结果

3.1 CGRP causes potent vasorelaxation in rat septal arteries

研究人员在具有肌源性张力的离体大鼠室间隔动脉中构建了CGRP累积浓度-反应曲线（1 pM–100 nM），发现CGRP能刺激强效的、浓度依赖性的血管舒张（Log EC₅₀= ?9.29 ± 0.13）。CGRP受体拮抗剂BIBN 4096以浓度依赖性方式抑制该舒张反应，证实了反应通过CGRP受体介导。

3.2 Vasorelaxation to CGRP was largely dependent on opening K⁺channels in the VSMCs

去除内皮（?EC）并不影响100 nM CGRP的最大舒张反应，但使浓度-反应曲线右移；而在高钾（45 mM K⁺）溶液中，CGRP的舒张反应被显著抑制（100 nM CGRP时仅剩14.8% ± 7.9%），表明CGRP血管舒张主要依赖于VSMC上K⁺通道的开放。

3.3 Vascular smooth muscle K_V7 and BK_Cachannels independently play predominant roles CGRP vasorelaxation of denuded septal arteries

使用1 μM linopirdine（K_V7抑制剂）或1 μM paxilline（BK_Ca抑制剂）单独处理去内皮动脉时，对100 nM CGRP的舒张抑制无统计学显著性；但两者联合应用时，舒张被显著抑制（仅剩31.0% ± 8.3%）。K_ATP通道抑制剂glibenclamide（5 μM）不影响CGRP舒张，说明K_ATP通道在此反应中无主要作用。

3.4 K_V7 channels and BK_Cachannels expression on the ECs and VSMCs of rat septal arteries

免疫组织化学显示，K_V7.4、K_V7.5和BK_Ca（K_Ca1.1）通道在VSMC和内皮细胞（ECs）中均有表达，呈点状分布且在细胞内（包括核周）和膜上均有分布。

3.5 Nitric oxide contributes to endothelium-dependent relaxation independently of K⁺channel activation

内皮NOS抑制剂L-NAME（100 μM）不改变100 nM CGRP的最大舒张，但使浓度-反应曲线右移（类似去内皮效果）。在+L-NAME背景下，linopirdine或paxilline单独即可显著抑制CGRP舒张；而在无L-NAME时单独使用则无显著抑制。这表明在内皮完整时，NO与K⁺通道通路平行运作共同驱动CGRP舒张。

3.6 K_V7 channels, BK_Cachannels and NO contribute to CGRP-induced hyperpolarization in septal arteries

电生理记录显示，CGRP以浓度依赖性方式使VSMC超极化（100 nM CGRP: ΔE_m= ?20.6 ± 3.0 mV），其Log EC₅₀略低于同时记录的血管舒张Log EC₅₀，说明超极化持续至最大舒张之后。linopirdine与paxilline联合应用显著抑制CGRP超极化与舒张。在L-NAME存在时，linopirdine或paxilline单独即可几乎消除CGRP超极化。此外，linopirdine与paxilline联合会增加去极化锋电位的幅度，提示这些K⁺通道在抑制肌源性去极化锋电位及稳定张力中具有反馈作用。

3.7 Exogenous NO hyperpolarizes rat septal arterial VSMCs

在外加NOS抑制剂L-NAME背景下，NO供体IPA-NO（HNO供体）和SNAP（NO•供体）均可引起VSMC适度超极化（10 μM IPA-NO: ΔEm = ?9.8 ± 1.3 mV；10 μM SNAP: ΔEm = ?12.3 ± 2.9 mV），并能抑制去极化锋电位，说明NO本身可直接导致超极化。

3.8 CGRP vasorelaxation is partially mediated by the Gβγ subunit

Gβγ抑制剂gallein（100 μM）在内皮完整与去内皮动脉中均使CGRP浓度-反应曲线在低浓度区显著右移（10 nM CGRP舒张被大幅抑制），但100 nM CGRP仍保留部分gallein不敏感舒张。该残留舒张可被linopirdine进一步抑制，提示其主要通过K_V7.4/5通道介导。gallein与L-NAME联合也额外抑制CGRP舒张，提示可能涉及NO对K_V7通道的作用。在去内皮动脉中，gallein、linopirdine、paxilline三者联合才将100 nM CGRP舒张抑制到24.5% ± 7.3%，说明CGRP激活一条不依赖于Gα_s（如异丙肾上腺素所用）的Gβγ介导通路。

讨论与结论总结

本研究在具有肌源性张力的离体大鼠冠状室间隔动脉中，明确了CGRP诱导血管舒张的信号机制。研究表明低浓度CGRP依赖BIBN敏感的CGRP受体上的Gβγ亚基来刺激血管舒张，其中K_V7（对linopirdine敏感）与BK_Ca（对paxilline敏感）通道起主要作用；CGRP舒张伴随VSMC超极化，并可抑制去极化锋电位。虽然CGRP舒张不依赖内皮，但NO可提供平行贡献并本身引起超极化，且K_V7与BK_Ca通道在ECs与VSMCs中均有表达。研究指出，CGRP受体Gβγ亚基如何激活K_V7与BK_Ca通道尚待阐明，可能涉及AKAP、Epac、小GTP酶或直接钙释放等机制；而gallein不敏感成分可能涉及NO-cGMP-PKG激活K_V7通道。由于仅使用雄性大鼠，结论未必适用于雌性，而性别差异在CGRP信号及冠心病、偏头痛等疾病中可能存在重要意义。总之，CGRP是冠状小动脉强效血管舒张剂，通过Gβγ亚基介导VSMC超极化（涉及K_V7与BK_Ca通道）及并行NO通路来抑制冠状血管反应性，这一发现有助于理解冠状微血管生理及冠状动脉微血管功能障碍的机制，并为相关治疗策略提供依据。