《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：Seroprevalence of Coronavirus NL63 in Yamagata, Japan, Between 1976 and 2022
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推进季节性冠状病毒（CoV）流行病学方面的研究，对于理解CoV传播动力学以及加强针对新发CoV感染的防控策略具有重要意义。其中，CoV-NL63作为一种于2003年发现的季节性CoV，其流行病学特征尤其是2003年之前的流行情况尚不清楚。为了分析日本山形县Co
推进季节性冠状病毒（CoV）流行病学方面的研究，对于理解CoV传播动力学以及加强针对新发CoV感染的防控策略具有重要意义。其中，CoV-NL63作为一种于2003年发现的季节性CoV，其流行病学特征尤其是2003年之前的流行情况尚不清楚。为了分析日本山形县CoV-NL63的血清流行率，研究人员采用了微量中和试验（microneutralization test），使用了1976年、1990年、2010年、2019年和2022年收集的146至379份血清样本，这些样本来自0～4岁、5～19岁、20～39岁以及≥40岁这四个年龄组，并使用山形县分离株进行检测。由于针对其他季节性CoV的方法尚未建立，研究人员仅测量了针对CoV-NL63的中和抗体（NT Abs）。各年份的总NT Ab阳性率为68.0%–90.4%。0–4岁年龄组的Ab阳性率在各年份中为21.3%–65.2%，而4岁以上个体的阳性率在整个研究期间介于73.3%至100%之间。研究人员尚不清楚季节性CoV之间交叉反应免疫的影响。本研究表明，针对CoV-NL63的血清流行率随年轻一代的年龄增长而增加，随后在高水平达到平稳状态，这表明可能发生再感染，并且CoV-NL63在尚未被鉴定之前就已经在婴儿和儿童中传播。
该研究论文发表于《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》。研究背景主要围绕季节性冠状病毒（CoV）的流行病学展开。冠状病毒（CoV）是广泛分布于人类和蝙蝠等哺乳动物中的有包膜RNA病毒，其中七种与人类疾病相关，包括四种引起普通感冒的季节性CoV：甲型冠状病毒CoV-229E和CoV-NL63，以及乙型冠状病毒CoV-OC43和CoV-HKU1；此外还有三种高致病性CoV，即SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。CoV-NL63于2003年首次从一名患细支气管炎的7月龄婴儿中被分离和鉴定，虽呈世界性分布且多引起轻微上呼吸道症状，但其2003年之前的流行病学数据极为匮乏。日本山形县公共卫生研究所（Yamagata Prefectural Institute of Public Health, YPIPHEC）自1999年起便开展急性呼吸道感染儿童的病毒分离监测，此前分子检测显示冬季是当地儿童四种季节性CoV感染的主要流行季，且气-液界面（Air-liquid interface, ALI）原代人类气道上皮培养技术使得CoV-NL63的分离与传代成为可能。然而，针对2003年之前CoV-NL63的血清流行病学调查十分有限，了解历史性季节性CoV流行情况对理解CoV传播动力学及应对如SARS-CoV-2等新发感染具有重要意义。为此，研究人员开展了一项纵向血清流行病学研究，旨在明确CoV-NL63在2003年被发现前后于日本山形县的感染发生情况。
研究人员采用的关键技术方法主要包括：获取并筛选日本山形县居民在1976年、1990年、2010年、2019年和2022年（5月至8月非流感流行季）收集的人类血清样本队列（源于日本厚生劳动省领导的疫苗可预防疾病国家流行病学监测）；使用在该地区分离并传代的CoV-NL63山形分离株（NL63/Yamagata.JPN/2016-854），通过微量中和试验（microneutralization test）在LLC-MK2细胞系中检测血清样本里针对CoV-NL63的中和抗体（NT Ab）滴度；设定血清稀释度从1:8至1:512进行倍比稀释，以中和抗体滴度≥1:8定义为血清阳性，从而按不同年龄组统计各年份的抗体阳性率及滴度分布。
研究结果如下：
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Results（结果）
研究人员统计了1976年、1990年、2010年、2019年和2022年各年龄组（0–4岁、5–19岁、20–39岁、≥40岁）的血清样本数量及中和抗体（NT Ab）阳性率。结果显示，每年总血清样本的抗体阳性率为68.0%–90.4%。0–4岁年龄组每年的抗体阳性率为21.3%–65.2%，而4岁以上个体各年的抗体阳性率介于73.3%–100%。此外，研究人员还分析了不同抗体滴度（1:8–1:16、1:32–1:64、1:128–1:256及>1:256）在各年份血清阳性个体中的占比，其中1:8–1:16和1:32–1:64分别占43.2%–68.6%和30.6%–50.0%，较高滴度占比较低，仅2019年有一名居民滴度大于1:256。
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Discussion（讨论）
讨论部分指出，既往山形县及其他研究显示CoV-NL63感染常见于儿童期，且抗体阳性率随年龄增长而增加。山形县先前研究发现CoV-NL63几乎每年冬季都在6岁以下婴幼儿中流行，中位年龄为3岁。其他研究也表明婴儿3至6月龄时缺乏针对CoV-NL63刺突糖蛋白的中和抗体（NT Abs），但成人血清均含有高水平NT Abs；出生时因母源抗体导致的高抗体水平会在3个月内下降至极低，此后血清阳性个体比例随年龄增长而升高，多数3.5岁以上儿童呈血清阳性。本研究的山形数据同样显示，年轻世代中CoV-NL63血清流行率随年龄增长上升，并在4岁以上个体中维持在73.3%以上的高位平台期，这进一步支持了CoV-NL63在幼儿中感染的普遍性。
另一讨论要点为，5岁及以上个体持续的高血清阳性率可能意味着初始感染后在5岁左右开始频繁发生再感染。因为CoV感染后的抗体滴度会下降，且针对四种季节性CoV的保护性免疫持续时间较短，人类可能在生活中反复受这些病毒影响。
研究人员还提到，尽管使用不同病毒株（Amsterdam-1株）和临界值（1:10）的澳大利亚2020年健康成人研究报道71%的血浆样本含NT Abs，本研究的73.3%–100%稍高，可能与山形县2010至2019年间CoV-NL63几乎每年冬季流行导致的区域性流行状态有关。
关于季节性CoV感染间是否存在交叉反应抗体，研究人员表示尚不确定，解读季节性CoV间的交叉免疫较为困难，且由于完整的暴露史未知，交叉免疫程度尚不明确。
由于CoV-OC43和CoV-HKU1仅能在ALI培养中生长，且针对CoV-229E测量NT Abs的方法尚未在该实验室建立，本研究未测量针对其他季节性CoV的NT Abs。
重要的是，研究人员在1976年和1990年（即CoV-NL63于2003年被发现之前）的血清样本中观察到了与上述一致的按年龄组分层的抗体阳性率趋势，这表明至少自1970年代起CoV-NL63的传播已在山形县持续存在。这与系统发育分析估计CoV-NL63约于1927年从CoV-229E分化并感染人类，以及 retrospective investigation 在1981年和1988年人类样本中检出CoV-NL63的结果不冲突。
最后，研究人员提及了研究局限性，即血清标本较老旧，不确定储存期间NT Ab滴度下降程度，但既往山形研究显示至少可测得1:1024的NT Ab滴度。
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Conclusions（结论）
这项在山形县开展的纵向血清流行病学研究表明，CoV-NL63在其被鉴定之前，即介于1970年代至1990年代期间，就已经在人群中流行传播。
