一种用于重组蛋白自展示及其优化的质粒工具箱

《Communications Biology》：A plasmid toolbox for the easy autodisplay of recombinant proteins and its optimization

　　

细菌表面展示蛋白技术在结合研究、文库筛选或酶抑制剂检测等方面具有诸多优势。研究人员在此介绍了一套用于基于自展示（autodisplay）的重组蛋白表面表达的质粒，命名为自展示工具箱（Autodisplay-ToolBox, ATB）。该工具箱中，自展示所需的关键元件，包括启动子（promotor）、信号肽（signal peptide, SP）、连接肽（linker）和β-桶蛋白（β-barrel），可以不同的排列组合进行搭配，以寻找针对特定蛋白的最佳组合。这些质粒可单独使用，也可用于文库筛选方法，实现表面展示的单步优化。通过此类文库筛选方法，表面展示的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, β-Gluc）活性提高了4.9倍，漆酶（laccase, CotA）活性提高了4.7倍，表面展示的人超极化激活环核苷酸门控离子通道HCN2核苷酸结合域（human hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated ion channel 2 - cyclic nucleotide binding domain, HCN2-CNBD）的结合能力提高了10.3倍。研究表明，ATB可用于不同的大肠杆菌（E. coli）菌株以及恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。该研究旨在提供一套可通过Addgene获取的质粒，供科研人员针对自身研究的蛋白进行使用，既可基于个人偏好、结构特征等进行单独选择，也可作为文库使用，如本研究所示的三个不同实例。

## 研究背景与意义

细菌表面展示技术因其在结合研究、文库筛选和酶抑制剂检测等方面的优势而备受关注。噬菌体展示技术曾荣获2018年诺贝尔化学奖，而细菌展示技术在展示蛋白尺寸、展示蛋白数量以及适用筛选方法等方面较噬菌体展示具有潜在优势，且选定的细菌展示变体可直接扩增，无需像噬菌体展示那样进行多轮感染和选择循环。

对于革兰氏阴性菌如大肠杆菌（E. coli），一种简单的重组蛋白表面展示方法基于Va型自转运体（type Va autotransporter, AT）蛋白的分泌机制，即所谓的"自展示"（autodisplay）。经典自转运体以单一多结构域前体形式合成，具有共同结构特征：N端信号肽（SP），随后为天然乘客结构域、通常包含至少一个α螺旋的连接肽，以及C端β-桶蛋白。在通过Sec转运体依赖途径跨越内膜运输过程中，信号肽被切除；多种分子伴侣协助未折叠的自转运体穿过周质空间到达β-桶蛋白组装机制（β-barrel assembly machinery, BAM）。BAM促进β-桶蛋白的折叠和外膜整合，乘客结构域通过BamA形成的杂交β-桶以C端到N端方向转位至细胞表面，其关键驱动力为C端片段在细胞表面的折叠。折叠后的乘客结构域仍以C端与作为表面锚定蛋白的β-桶蛋白相连。自展示技术即用目标蛋白替代天然乘客结构域，但需注意宿主菌株需为外膜蛋白酶T（OmpT）阴性，且乘客结构域不能具有自蛋白水解活性。

以往研究分别对自转运体融合蛋白的不同结构域进行了优化，包括连接肽、β-桶蛋白或启动子等，但组合克隆策略以排列信号肽、连接肽和β-桶蛋白等结构域的方式尚未被应用。本研究旨在提供一套质粒工具箱，既可满足研究者针对特定蛋白的定制化表面展示需求，又能通过文库方法在单步操作中筛选出最优的结构域组合。该研究成果发表于《Communications Biology》。

## 关键技术方法

研究人员构建了名为自展示工具箱（ATB）的质粒库，基于最大化自转运体介导表达（maximized autotransporter-mediated expression, MATE）质粒骨架，包含三类启动子（ParaBAD、PrhaBAD、PRox306）、四种信号肽（CtxB、OprF及其与EstA前导肽间隔区的组合）、六种连接肽（表位标签型epitope、柔性flex、刚性rigid及三种缺失变体Δepitope、ΔepitopeΔβ1、ΔepitopeΔβ1ΔCR）以及经典EhaA β-桶蛋白和反向YeeJ β-桶蛋白，共计81种质粒。文库构建采用三种策略：逐步克隆法（step-by-step）、一体库法（all-in-one，质粒混合后酶切连接）和菌株混合法（strain-mix，利用冻存菌株混合库扩增质粒）。筛选在96孔板中进行，分别以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）和荧光配体8-Fluo-cAMP为底物检测β-葡萄糖苷酶、漆酶活性及HCN2-CNBD结合能力。验证实验采用200 mL或20 mL规模培养，通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glc-6-P dehydrogenase）检测评估细胞裂解，利用流式细胞术（flow cytometry）分析表面展示水平，并通过SDS-PAGE和密度分析量化膜蛋白表达。

## 研究结果

### AT-FP经典组成型变体的构建

ATB中的自转运体融合蛋白（AT-FP）包含来自霍乱弧菌CtxB或恶臭假单胞菌OprF的信号肽，可选的EstA前导肽间隔区（spacer），以及必需的六组氨酸标签（His6-tag）和Xa因子蛋白酶切位点。乘客结构域初始为Hahella chejuensis来源的Cel5，通过后接六种不同连接肽与EhaA AT β-桶蛋白相连。连接肽包括：含标签的表位型（epitope，预测为无规卷曲）、高柔性的G4S-G2S-(G4S)3序列（flex，无规卷曲结构）、刚性的A(EAAAK)5序列（rigid，α-螺旋结构），以及三种缺失变体（仅保留β1结构域和连接区Δepitope、仅保留连接区ΔepitopeΔβ1、完全缺失连接区直接融合ΔepitopeΔβ1ΔCR）。所有变体均包含EhaA AT β-桶蛋白所需的额外α-螺旋。这些质粒在三种启动子调控下表达，最终构建72种质粒的经典组成型ATB文库。

### β-葡萄糖苷酶文库的逐步构建与连续筛选

以Caldivirga saccharolytica来源的β-葡萄糖苷酶BglA LYTH（β-Gluc，54.8 kDa）为模型乘客，通过KpnI/XhoI位点替换初始Cel5乘客，构建24种PrhaBAD启动子调控的pATB-β-gluc变体。每种质粒转化大肠杆菌后，随机选取单菌落进行96孔板小规模培养，以pNPG为底物检测酶活性。结果显示所有变体均具有活性，但存在显著差异。与参考组合PrhaBAD-ctxB-β-gluc-epitope-ehaA（pATB_211-β-gluc）相比，最优变体为PrhaBAD-oprF-spacer-β-gluc-ΔepitopeΔβ1-ehaA（pATB_245-β-gluc），活性达12.06 mM pNP/mL_OD578nm。该逐步筛选方法虽有效，但劳动密集且耗时，促使研究人员开发更简便的文库策略。

### β-葡萄糖苷酶文库的一体制备与菌株混合制备筛选

一体库法将24种pATB-cel5质粒等摩尔混合，酶切去除Cel5后连接β-gluc插入片段，转化大肠杆菌后获得305个单克隆文库，筛选105个克隆达到98.5%统计覆盖率。菌株混合法则利用各24种pATB-cel5转化子的混合冻存库存，从中扩增质粒后进行相同的酶切连接操作，获得298个单克隆文库。两种方法的活性分布模式、与参考相比的显著差异比例及最优变体鉴定结果高度一致，均筛选出相同的最佳变体pATB_245-β-gluc。Kolmogorov-Smirnov检验（K-S检验）证实两种方法无显著偏倚（D=0.13, p=0.32），表明简化的文库制备方法不会影响筛选结果。

### 高酶活性大肠杆菌pATB-β-gluc变体的分析验证

在200 mL规模验证实验中，最优变体pATB_245-β-gluc的酶活性达948 mU/mL_OD578nm，较参考值193 mU/mL_OD578nm提高4.9倍。SDS-PAGE密度分析显示该变体表面展示水平约为参考的1.9倍，而流式细胞术检测则显示各变体表面展示水平相近。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测证实细胞裂解率极低（0.2-0.4%），排除了细胞破碎导致活性差异的可能性。将活性标准化处理后发现，最佳变体的单位展示蛋白活性较参考提高5.9倍，提示OprF-spacer信号肽与ΔepitopeΔβ1连接肽的组合具有协同增效作用。

### AT-FP反向组成型变体的构建

针对某些酶在经典AT结构中C端连接β-桶蛋白导致活性不足的问题，研究人员将反向自转运体YeeJ整合入ATB。反向AT-FP以YeeJ信号肽起始，依次为LysM域、反向YeeJ β-桶蛋白、含侵袭素域3（ID3）的天然连接肽，以及C端Cel5乘客结构域。连接肽区域可插入His6fXa、His6fXa-flex或His6fXa-rigid序列。三种变体（x51-x53）与三种启动子组合扩展ATB至81种质粒。以β-Gluc为乘客的功能验证显示，反向组成型变体虽具活性，但低于经典结构的参考组合，表明反向结构并非对所有乘客均有利。

### ATB的进一步应用：细菌漆酶和人HCN2-CNBD

以恶臭假单胞菌为宿主、ParaBAD为启动子，对来自Bacillus coagulans的漆酶CotA进行菌株混合法文库筛选。90个克隆的活性检测在统计上覆盖98%的理论变体，最优变体ParaBAD-oprF-spacer-cotA-flex-ehaA（pATB_142-cotA）活性达280 mU/mL_OD578nm，较参考值60 mU/mL_OD578nm提高4.7倍。验证实验确认细胞完整性良好（裂解率约0.1%），且ATB可成功应用于除大肠杆菌外的其他革兰氏阴性菌。

对于人HCN2-CNBD的首次表面展示，采用荧光配体8-Fluo-cAMP进行两轮筛选。首轮110个克隆的96孔板筛选中，42个变体荧光强度显著高于参考；第二轮24个变体的流式细胞术验证表明，最优变体ParaBAD-oprF-hcn2-cnbd-Δepitope-ehaA（pATB_124-hcn2-cnbd）的8-Fluo-cAMP结合量较参考提高10.3倍（mFI 1672 vs 163），ParaBAD-oprF-spacer-hcn2-cnbd-epitope-ehaA（pATB_141-hcn2-cnbd）提高8.4倍。His6标签抗体染色证实所有变体均成功展示于细胞表面，且结合量的增加与展示水平相关。

## 讨论与结论

ATB最终包含81种质粒，用于分析启动子、信号肽、连接肽和β-桶蛋白的排列组合对乘客蛋白表面展示效率的影响。两种文库方法的应用使β-Gluc和CotA的酶活性分别提高4.9倍和4.7倍，HCN2-CNBD的核苷酸结合能力提高10.3倍。

对于β-Gluc，活性提升并非单纯源于表面展示蛋白量的增加。逐步筛选结果支持OprF-spacer信号肽与ΔepitopeΔβ1连接肽存在协同增效的假设：最佳变体的活性高于单独使用最优信号肽或最优连接肽的变体活性之和。总体而言，flex连接肽和ΔepitopeΔβ1连接肽对活性有积极影响，OprF信号肽表现出显著优势，而间隔区的作用尚不明确。这些结果表明ATB适用于提高重组酶的表面展示活性。

最佳信号肽与特定乘客及表达宿主相关，但研究发现源自恶臭假单胞菌的OprF信号肽在E. coli和P. putida中均表现优异，提示有限数量的信号肽可能足以进行初步筛选。连接肽的作用在于将乘客置于"最佳位置"——即灵活性、空间取向、结构折叠和转位效率的最优组合，而这一"最佳位置"因乘客不同而异。研究无法揭示适用于所有乘客的通用规则，这更凸显了ATB作为便捷优化平台的价值。

需要指出的是，筛选结果反映的是特定参数下的最佳变体，性能提升可能源于展示量增加、乘客功能改善或两者共同作用。环境参数如培养基和温度也可能与工具箱改进产生协同效应。

ATB的一体库法提供简便的现成质粒批次，而菌株混合法则可从冻存库按需快速扩增文库。虽然本研究限于革兰氏阴性菌，但该概念可拓展至革兰氏阳性菌。文库筛选需注意潜在偏倚，建议通过深度测序等方法进行定量评估。研究者也可基于乘客特征进行理性选择，如C端活性位点乘客可选用YeeJ反向结构。所有81种质粒及混合文库均可通过Addgene获取。

本研究通过提供模块化的质粒工具箱，实现了自展示技术中关键结构域的系统优化，为重组蛋白的表面展示研究提供了高效、灵活的技术平台。