《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Co-Occurrence of Biofilm Formation and Disinfectant–Antimicrobial Resistance in Staphylococcus spp. Along the Dairy Production Chain
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本研究旨在探究从乳制品生产链不同阶段分离的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）中生物膜形成能力与消毒剂、抗菌药物抗性的共现情况，并评估这些性状对乳制品加工环境中菌株持留的贡献。研究人员共回收51株葡萄球菌属分离株，包括凝固酶阳性（coagula
本研究旨在探究从乳制品生产链不同阶段分离的葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）中生物膜形成能力与消毒剂、抗菌药物抗性的共现情况，并评估这些性状对乳制品加工环境中菌株持留的贡献。研究人员共回收51株葡萄球菌属分离株，包括凝固酶阳性（coagulase-positive staphylococci, CPS）与凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci, CoNS），来源涵盖生乳、乳制品及消毒后食品接触面。通过表型试验评估生物膜与黏泥形成能力，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测生物膜相关基因（icaA、icaD、bap）与消毒剂抗性相关基因[qac（A、B、C、G、H、J）、mdeA、lmrS、norA]。抗菌药物敏感性采用纸片扩散法测定，消毒剂抗性采用肉汤微量稀释法评估。结果显示，52.9%的分离株可检测到生物膜和/或黏泥形成，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）占89%，凝固酶阴性葡萄球菌占45.2%。苯唑西林（oxacillin）抗性检出率最高（94.1%），其次为四环素（tetracycline, 29.4%）与红霉素（erythromycin, 17.6%）。消毒剂敏感性降低最常见于季铵化合物（quaternary ammonium compounds, QACs）类消毒剂（62.7%），磷酸酸基、氯基及过氧乙酸基消毒剂的抗性检出率为17.7%~35.3%。结果表明，乳制品生产链中的葡萄球菌属可同时具备生物膜形成能力、常用消毒剂敏感性下降及高水平抗菌药物抗性，其中苯唑西林与QACs抗性尤为普遍。上述发现凸显了乳制品生产链中存在抗性葡萄球菌属，强调需优化卫生与控制策略以降低风险。
论文解读
研究背景与意义
葡萄球菌属广泛存在于人与动物自然菌群中，并与牛乳腺炎密切相关，是乳制品生产链中常见的污染微生物。根据凝固酶产生能力可分为凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌，前者中的金黄色葡萄球菌因致病潜力与获得抗菌药物抗性的能力成为重要食品安全风险因子，而后者曾被认为毒力较低，近年研究证实其可在食品生产环境中持留并成为抗性决定簇的储存库。生物膜形成可增强细菌在环境压力下的存活能力，通过限制活性化合物渗透与改变细胞代谢活动降低对抗菌药物与消毒剂的敏感性。与此同时，葡萄球菌属对消毒剂的敏感性下降已成为食品生产系统的突出问题，尤其是季铵化合物、氯制剂与氧化类消毒剂的敏感性降低，反复暴露、亚抑制浓度、卫生操作不规范与生物膜存在均可能促进耐受株的选择。遗传层面，qac基因与mdeA等消毒剂抗性相关基因的存在反映了其在频繁使用消毒剂环境中的适应潜力，且既往研究提示消毒剂抗性基因可能与抗菌药物抗性决定簇及生物膜相关性状共现。乳制品营养丰富，支持葡萄球菌生长持留，生产各环节中细菌反复暴露于消毒剂与抗菌药物，但针对乳制品相关葡萄球菌的生物膜形成、消毒剂抗性、相关基因与抗菌药物抗性的共现数据仍较有限，尤其缺乏按分离源的分类评估。因此，本研究以土耳其5家乳制品工厂的分离株为对象，系统分析上述性状的关联，为解析抗性菌株持留机制与制定防控策略提供依据。
主要技术方法
研究人员纳入此前从土耳其5家乳制品工厂分离的51株葡萄球菌属，包括9株凝固酶阳性葡萄球菌（均为金黄色葡萄球菌）与42株凝固酶阴性葡萄球菌，覆盖表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等9个种；分离源包括生乳（生产入口）、乳制品（生产出口）及食品接触面（不锈钢管道、罐体、塑料容器等）与非食品接触面（墙砖、废水管等）。采用刚果红琼脂平板培养与微孔板结晶紫染色法定量评估生物膜与黏泥形成表型，以PCR检测icaA、icaD、bap生物膜相关基因及qac系列、mdeA、lmrS、norA消毒剂抗性相关基因。消毒剂敏感性采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）与最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC），抗菌药物敏感性采用纸片扩散法依据临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）指南判定。统计分析采用卡方检验、Fisher精确检验、Spearman相关性分析与二元Logistic回归模型，显著性水平设为p<0.05。
研究结果
3.1 生物膜形成与基因检测
51株分离株中，52.9%在刚果红琼脂上呈黏泥阳性，微孔板试验中45.1%为弱生物膜生产者、7.8%为强生物膜生产者。金黄色葡萄球菌的生物膜/黏泥阳性率最高（89%），显著高于凝固酶阴性葡萄球菌（59.5%）。icaD基因仅在凝固酶阴性葡萄球菌中检出（11.8%），所有分离株均未检出icaA与bap基因。icaD与qacAB基因阳性株均为生物膜/黏泥阳性，mdeA阳性株也全部为生物膜阳性，上述关联均具统计学意义。
3.2 消毒剂抗性与基因检测
季铵化合物的MIC范围为6%~12%（v/v），30分钟接触时62.7%的分离株对推荐浓度（3%）耐药，24小时孵育后有24株出现再生长。磷酸酸基、氯基、过氧乙酸基消毒剂的30分钟耐药率分别为35.3%、19.6%、17.7%，无醇类消毒剂耐药株。11.8%的分离株携带qacAB基因，3.92%携带mdeA基因，未检出smr、qacG、qacH、qacJ、lmrS、norA基因。季铵化合物抗性分离株的生物膜阳性率显著高于敏感株（30分钟：65.6% vs 34.4%；24小时：66.7% vs 33.3%），其余消毒剂无此关联。
3.3 抗菌药物抗性
96.1%的分离株对至少1种抗菌药物耐药，苯唑西林耐药率达94.1%，其次为四环素（29.4%）、红霉素（17.6%），环丙沙星、利福平均为3.9%，克林霉素与复方磺胺甲噁唑为2.0%。43.1%的分离株对2种抗菌药物耐药，7.84%为多药耐药（multidrug-resistant, MDR，定义为对≥3类抗菌药物耐药）。多药耐药状态与生物膜阳性、季铵化合物抗性均无显著关联。
3.4 按分离源的生物膜/黏泥形成、消毒剂与抗菌药物抗性
生物膜/黏泥阳性株主要来源于不锈钢表面（50.0%）与乳制品（37.0%），icaD基因阳性株多来自不锈钢、塑料与瓷砖表面。所有乳制品、瓷砖与塑料表面的分离株均为苯唑西林耐药，不锈钢与布类表面耐药率分别为95.5%与50.0%。季铵化合物抗性在不锈钢、乳制品与生乳分离株中分别达63.7%、68.8%与100%。相关性分析显示，黏泥产生与弱生物膜形成、生物膜形成与遗传标记、短期与长期季铵化合物暴露结果均呈强相关；qacAB基因与长期季铵化合物耐受、mdeA基因与强生物膜形成也呈显著相关。
讨论与结论
生物膜阳性率在不同生产阶段无显著差异，提示该性状在生产过程中相对稳定。icaD基因仅见于凝固酶阴性葡萄球菌的表面分离株，icaA与bap基因的缺失表明存在非ica/bap依赖的生物膜形成机制。消毒剂抗性以季铵化合物最为普遍，qacAB基因检出与长期耐受相关，符合其作为消毒剂选择压力的适应性响应。抗菌药物抗性以苯唑西林为主，绝大多数分离株仅对单一类别耐药，导致多药耐药比例较低。生物膜形成与季铵化合物抗性显著相关，但多药耐药与生物膜、季铵化合物抗性无显著关联，提示生物膜对消毒剂耐受的贡献可能大于qacAB介导的外排机制。不同分离源的耐药模式差异反映了生产环境中多重选择压力的存在。
研究结论指出，乳制品生产链多环节检出抗性葡萄球菌属，存在沿食物链传播抗菌药物抗性的潜在风险。研究局限在于未分析基因表达动态，也未通过实验验证消毒剂暴露与抗性发展的因果关系，但结果强调了需谨慎管理乳制品生产中的消毒剂与抗菌药物使用，定期审查卫生规程的重要性。本研究发表于《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》。
