《Nature Biomedical Engineering》：Large-scale and innervated functional human gut tissues for transplantation via transient spheroid confinement
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当前人源胃肠道类器官（organoids）的主要局限性在于其生理成熟度不完全，且为了整合用于移植的功能性神经系统，往往需要复杂且耗时的组装体（assembloid）构建方法。本研究提出了一种受限培养系统（confined culture system, CCS
当前人源胃肠道类器官（organoids）的主要局限性在于其生理成熟度不完全，且为了整合用于移植的功能性神经系统，往往需要复杂且耗时的组装体（assembloid）构建方法。本研究提出了一种受限培养系统（confined culture system, CCS），该方法能够生成具有新生肠神经系统（enteric nervous system, ENS）的大规模、 elongated（长形）且功能性的人源小肠、结肠及胃组织。研究人员利用三维打印的支架托盘来限制类器官球体的融合与生长，从而促进功能性 ENS 的自发共同发育。转录组学和电生理学数据证实，组织内存在选择性神经肌肉功能以及兴奋性和抑制性神经元。与传统方法相比，CCS 加速了用于移植的组织成熟过程，生成的类器官体积可达以往方法的十倍，在培养 10 周后宽度可达 8 厘米，并表现出更高的移植嵌合率。CCS 类器官能够整合并适应小鼠的管腔环境，同时保持屏障完整性和功能容量。该方法简化了现有方案，加速了具有临床相关性的复杂功能性肠道组织的生产。
**研究背景与意义**
人 pluripotent stem cells (hPSCs) 技术的发展推动了特定组织的生成，其中类器官技术实现了“盘中器官发生”，为模拟原生组织、包含正确细胞类型及复现部分器官功能提供了可能。尽管 hPSC 衍生的胃肠道类器官在发育研究、疾病建模及药物发现方面展现出巨大潜力，但现有技术仍存在显著局限：体外表型往往不完全成熟，常需体内移植以继续分化；且传统培养产生的组织体积小、呈球形，与天然肠管结构差异大，移植嵌合率低。此外，构建具有功能性神经系统的组织通常依赖复杂的组装体策略，即分别分化神经嵴细胞再与类器官组合，操作繁琐且效率有限。因此，开发一种能简化流程、促进细胞复杂性、加速体内外成熟并实现大规模功能性 ENS 共发育的方法，对于推动肠道组织工程的临床转化至关重要。本研究发表在《Nature Biomedical Engineering》上，旨在解决上述问题。
**研究方法概述**
研究人员设计并制造了一种特制的生物相容性聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架托盘，该托盘具有纵向限制通道。研究将约 4,000 个由 hPSCs 分化而来的中后肠球体（mid-hindgut spheroids）加载至限制通道内，利用空间限制引导其融合与生长。这种受限培养系统（CCS）替代了传统的自由悬浮培养，使球体在 6 天内融合成统一的长形结构，随后取出并在基质胶中继续培养至第 14 天进行移植。研究采用了免疫缺陷大鼠（Rag1-和 Il2rg-缺陷型，RRG）作为移植宿主，以克服小鼠腹腔空间限制组织生长的问题。通过组织学染色、单核 RNA 测序（snRNA-seq）、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）以及离体器官浴电生理实验，全面评估了组织的形态结构、细胞组成、基因表达谱及神经肌肉功能。样本来源包括人源 hPSCs（H1 胚胎干细胞系及诱导多能干细胞系 72_3）以及移植后的人源化组织。
**研究结果**
**受限培养策略促进类器官生成与成熟**
通过引入支架托盘的受限培养策略，研究人员发现 SI CCS（小肠受限培养系统）类器官在体外培养 14 天即可达到移植标准，而传统人源肠道类器官（HIOs）通常需 28 天。移植后 10 周，SI CCS 移植物宽度可达 8 厘米，显著大于传统 HIOs，且保持了典型的肠道表型，包括增殖区带、分化良好的上皮细胞（如杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞）及上皮下 telocytes。形态计量分析显示，SI CCS 具有更深的隐窝、更高的绒毛和更厚的肌层，表明其结构成熟度显著提升。
**新生肠神经系统的共同发育**
研究意外发现，SI CCS 在无外源神经嵴细胞添加的情况下，自发形成了 robust（强健）的肌间神经丛。免疫荧光染色证实了泛神经元标记物（UCHL1, TUBB3, HuC/D）及特定亚型标记物（胆碱能 CHAT, 氮能 NOS1）的表达，且神经胶质细胞（S100B+）和 Cajal 间质细胞（KIT+）也与神经元紧密伴生。snRNA-seq 分析进一步证实，SI CCS 中存在丰富的神经胶质细胞群，且神经元亚型基因表达谱完整。与传统组装体方法生成的 HIO+ENS 相比，SI CCS 中的神经丛尺寸更大，表明受限环境更利于神经支配的有效形成。
**功能性神经肌肉耦合**
器官浴实验显示，SI CCS 组织表现出节律性的等长收缩，其收缩幅度与传统 HIO+ENS 相比显著增强，并与成人小肠相当。电场刺激（EFS）可诱发强烈的收缩反应，且该反应可被河豚毒素（TTX）阻断，证实了其对 ENS 的依赖性。药物阻断实验进一步揭示，SI CCS 的收缩活动由氮能和胆碱能神经元共同调节，其中胆碱能成分占主导。此外，平滑肌对毒蕈碱受体激动剂（bethanechol）呈剂量依赖性收缩，并可被拮抗剂（scopolamine）逆转，证明了独立于神经支配的功能性平滑肌的存在。
**CCS 促进 ENS 的早期发育状态**
转录组学对比分析显示，移植前的 d14 SI CCS 中富集了大量与早期 ENS 发育相关的基因本体。与 d28 HIO+ENS 相比，d14 SI CCS 中的神经群体表现出更高的早期神经前体细胞（如 ENCC/胶质前体、神经母细胞）比例，而晚期神经元标记物表达较低。这表明 CCS 诱导产生的 ENS 处于更早期的发育阶段，富含前体细胞，这可能是其移植后功能进一步成熟和扩增的关键。
**技术的普适性：结肠与胃组织**
研究人员将 CCS 方法扩展至结肠（C CCS）和胃（G CCS）组织的生成。结果显示，该方法同样显著提高了结肠和胃类器官的移植嵌合率和尺寸（结肠宽约 6 厘米）。组织学和功能学分析证实，C CCS 和 G CCS 均形成了具有区域特异性的上皮结构（如结肠的杯状细胞、胃的壁细胞和胃底腺），并同样共发育出了功能性的 ENS，表现出神经调节的平滑肌收缩活动。
**临床前概念验证：管腔内容物暴露实验**
为模拟临床生理环境，研究人员在大鼠模型中改进了"Tie-in"手术，将 SI CCS 移植物与宿主盲肠吻合，使其暴露于宿主管腔内容物。结果显示，SI CCS 能够成功适应管腔环境，维持屏障完整性，并在暴露后表现出增强的粘液分泌、改变的离子转运功能以及更成熟的神经肌肉反应。与小鼠模型相比，大鼠模型显著降低了手术死亡率，支持了长期观察。
**结论与讨论**
本研究开发的受限培养系统（CCS）通过简单的物理限制策略，成功实现了大规模、功能性且带有新生肠神经系统的人源肠道组织的生成。该方法无需复杂的组装体操作，显著缩短了体外培养时间，提高了移植效率和组织尺寸。研究证实，CCS 诱导的 ENS 源于内源性发育，具有兴奋性和抑制性神经元亚型，并能有效调节平滑肌收缩。此外，该技术适用于小肠、结肠和胃等多种胃肠道组织。通过"Tie-in"模型，研究人员进一步验证了 CCS 组织在体内生理环境下的适应性和功能成熟潜力。这一突破性进展为肠道疾病建模、药物筛选以及未来治疗肠道衰竭的细胞疗法提供了强有力的工具和希望，标志着胃肠道组织工程向临床转化迈出了关键一步。
