《The FASEB Journal》：Plasminogen Activator Inhibitor-1 is Internalized by Endothelial Cells via A Pinocytosis-Like Mechanism and Evades Degradation
编辑推荐：
摘要：纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI1）是一种分泌性蛋白酶抑制剂，但越来越多的证据支持PAI1在调节细胞内过程中的作用。PAI1以活性构象分泌，作为纤溶酶原激活物（PA）的诱饵。PA与PAI1之间的相互作用导致共价键连接。PAI1/PA结合细胞表面的LRP1
摘要：纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI1）是一种分泌性蛋白酶抑制剂，但越来越多的证据支持PAI1在调节细胞内过程中的作用。PAI1以活性构象分泌，作为纤溶酶原激活物（PA）的诱饵。PA与PAI1之间的相互作用导致共价键连接。PAI1/PA结合细胞表面的LRP1和uPAR，触发内化和降解。然而，最近研究表明，外源性PAI1直接与内皮细胞内的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）相互作用。研究人员旨在表征PAI1非降解性内化的途径。研究人员使用带有血凝素（HA）标签的PAI1构建体，通过细胞裂解物的Western blotting和免疫荧光显微镜，追踪培养内皮细胞中外源性PAI1的胞吞作用。研究人员证明，PAI1-HA通过非受体介导的机制主动内化，不依赖于网格蛋白介导的内吞作用或小窝（caveolae）。PAI1-HA的内化被阿米洛利（amiloride）的衍生物部分抑制，尽管它不依赖于用于巨胞饮作用的GTP酶Rac1和CDC42。内化后，PAI1-HA至少3小时内逃避降解。相比之下，PAI1/uPA在内化后30分钟内被降解。PAI1-HA的内化不依赖于LRP1和uPAR。研究人员提出了一个模型，即PAI1/PA通过LRP1和uPAR依赖的内吞作用被内吞，而潜伏态PAI可通过类胞饮机制被内化并逃避降解，促进旁分泌信号传导。
论文解读：纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI1）主要被表征为在负向调节纤维蛋白溶解中发挥作用的分泌蛋白，但近年来越来越被视为代谢综合征和急性炎症状态（如急性呼吸窘迫综合征）的生物标志物。除了抑制组织型纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）外，它还抑制其他丝氨酸蛋白酶。多个独立研究团队已证实细胞内PAI1的生物学活性。例如，在高尔基体内，PAI1抑制弗林蛋白酶原转化酶，导致胰岛素受体和ADAM17的成熟减少；PAI1直接与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）相互作用并抑制其活性；近期还观察到PAI1在细胞核内结合DNA，暗示其可能直接调节转录。然而，此前并不清楚这种主要具有信号肽并被分泌到细胞外空间的PAI1是如何被内吞并逃避溶酶体降解以发挥细胞内效应的。因此，研究人员旨在探索外源性PAI1被内皮细胞内化的机制。该研究发表在《The FASEB Journal》。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：使用带有C端血凝素（HA）标签或HIS标签的PAI1构建体，在COS7细胞中过表达以生成富集条件培养基；将此外源性PAI1-HA或PAI1-HIS添加到培养的脐静脉内皮细胞（HUVECs）、Ea.hy926细胞系、人脐动脉内皮细胞（HUAECs）以及人微血管内皮细胞（MVECs）中；通过Western blotting（使用抗HA、抗PAI1、抗HSP90等抗体）和免疫荧光显微镜（包括共聚焦显微镜，使用EEA1、LAMP1、LC3等标记物）检测内化情况；利用小干扰RNA（siRNA）沉默网格蛋白重链（CHC）、小窝蛋白1（Cav1）、发动蛋白2（Dyn2）、LRP1、uPAR、Rac1、CDC42等基因；使用化学抑制剂如EIPA（乙基异丙基阿米洛利）、Dynasore、诺考达唑（nocodazole）、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）、MG132以及受体相关蛋白（RAP）进行预处理；通过酸甘氨酸缓冲液洗涤去除细胞表面结合蛋白；评估剂量依赖性和饱和动力学；以及通过清洗后更换新鲜培养基的试验评估蛋白持久性。
3 结果
3.1 外源性PAI1被内皮细胞内吞
研究人员将PAI1-HA富集培养基添加到Ea.hy926内皮细胞或HUVECs中。外源性PAI1-HA在30分钟内被内皮细胞内化，并在2小时达到稳态。免疫荧光显微镜观察确认了PAI1-HA的内化，但仅一部分细胞显示内化的PAI1-HA，2小时时平均约为11%±10%，使用酪胺信号放大后可达到46%±8%。4°C下的内化极少，证实了这是一个主动过程。HUAECs同样在37°C而非4°C下内化PAI1-HA。
3.2 PAI1-HA摄取不依赖于经典内吞机制
研究人员通过siRNA沉默网格蛋白重链、小窝蛋白1或发动蛋白2，尽管沉默效率良好，但通过半定量Western blotting未显示PAI1-HA内化减少。沉默发动蛋白2显著减少了转铁蛋白（通过转铁蛋白受体依赖的网格蛋白介导内吞作用）的内化，但未影响PAI1-HA。Dynasore（发动蛋白2抑制剂）预处理也不改变PAI1-HA摄取。将重组PAI1-HIS以1 nM至1 μM的浓度添加到HUVECs中30分钟，内化呈剂量依赖性且未饱和。沉默内源性PAI1不影响外源性PAI1-HIS的内化。这些结果表明PAI1-HA内化不采用受体介导的内吞作用。
3.3 PAI1-HA摄取具有巨胞饮作用的特征
非饱和内吞动力学暗示了一种非受体依赖的摄取机制。内皮细胞利用巨胞饮作用进行成纤维细胞生长因子（FGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的信号传导。阿米洛利是一种Na+/H+交换抑制剂，可抑制巨胞饮作用。研究人员假设PAI1-HA内化可能通过巨胞饮作用发生。用EIPA（阿米洛利衍生物）预处理导致PAI1-HA内化约减少50%，并阻断了液相胞饮作用标记物荧光黄的内化。诺考达唑（微管形成和巨胞饮作用抑制剂）预处理也使PAI1-HA内化减少约50%。然而，沉默Rac1或CDC42（用于巨胞饮作用的小GTP酶）均未减少PAI1-HA内化。PMA（报告称可刺激巨胞饮作用）预处理反而减少了PAI1-HA摄取。这些发现表明PAI1-HA摄取具有类似于但不完全等同于巨胞饮作用的特征。
3.4 PAI1-HA可在内皮细胞中逃避快速降解
研究人员将PAI1-HA富集培养基添加到HUVECs中2小时，然后移除、洗涤并添加新鲜完全生长培养基。PAI1-HA在内皮细胞中持续存在至少3小时，在MVECs中也得到确认，并通过免疫荧光显微镜可视化。PAI1-HA与早期内体标记物EEA1具有中等程度的共定位（Pearson系数0.57±0.20），但与溶酶体标记物LAMP1无共定位（Pearson系数0.35±0.18）。用MG132（蛋白酶体抑制剂）阻断了清洗期后细胞裂解物中PAI1-HA的减少，暗示最终通过蛋白酶体降解。PAI1-HA与自噬体标记物LC3无共定位（Pearson系数0.08±0.11）。这些数据支持PAI1-HA在内化后逃避溶酶体降解，但最终被蛋白酶体降解的假设。
3.5 PAI1-HA内化不同于PAI1-uPA内化
虽然前述结果显示PAI1-HA持续存在，但先前工作表明PAI1/uPA在内化后迅速降解。研究人员将PAI1-HA和PAI1/uPA复合物添加到内皮细胞中30分钟。PAI1-HA在30分钟内化并在1小时清洗期后持续存在于细胞中；PAI1/uPA在30分钟时可检测到，但在1小时清洗后不再可检测。PAI1/uPA内化依赖于LRP1和uPAR。沉默LRP1和uPAR不影响PAI1-HA内化（Western blotting和免疫荧光）。用RAP（阻断LRP1）预处理对PAI1/uPA内化仅有少量减少，酸洗涤显示大部分PAI1/uPA未真正内化；而RAP对PAI1-HIS内化无影响，且酸洗涤后PAI1-HIS丰度无差异。这些发现进一步证明潜伏态外源性PAI1比PAI1/uPA更大程度地被内皮细胞内化，且极少利用LRP1。
4 讨论
研究人员在此探讨了外源性PAI1如何被内皮细胞内化。确认外源性PAI1在体外被内皮细胞主动内化，并与早期内体标记物EEA1共定位。令人惊讶的是，使用化学抑制剂和基因沉默，发现PAI1进入不依赖于网格蛋白介导的内吞作用或小窝。PAI1在暴露2小时内在内皮细胞中达到稳态，但30分钟内的内化在高达1 μM PAI1时未饱和。此外，内源性PAI1表达的改变不影响外源性PAI1的内化，这与非受体介导的过程一致。PAI1内化被EIPA和诺考达唑抑制，暗示一种类巨胞饮机制。然而，与巨胞饮作用不同，PAI1内化不依赖于Rac1或CDC42，且不被PMA刺激。重要的是，这种内吞机制使PAI1能够逃避溶酶体降解，在内皮细胞中持续至少3小时，然后进行蛋白酶体降解。相比之下，PAI1/uPA复合物仅部分内化，并在内化后迅速降解。此外，PAI1/uPA内化利用LRP1，而潜伏态PAI1内化不受阻断LRP1的影响。基于这些发现，研究人员提出了一个模型：PAI1根据其构象对内皮细胞产生不同影响。潜伏构象的PAI1（如PAI1-HA、PAI1-HIS）通过类巨胞饮机制内化并转运至eNOS，而PAI1/uPA与LRP1相互作用并在内化后被降解。
研究结论翻译：总之，研究人员证明PAI1通过受体非依赖的方式被内皮细胞主动内化，这使其能逃避降解。研究人员最近发现外源性PAI1抑制eNOS活性，暗示了这些发现的直接细胞内机制。鉴于PAI1有助于病理的多种机制，更好地理解其生物学至关重要。此处报告的研究提出了外源性PAI1进入细胞内空间的一种替代机制。
