二酰基甘油激酶η（DGKη）作为NRAS突变黑色素瘤的新型治疗靶点

《Pigment Cell & Melanoma Research》：Diacylglycerol Kinase Eta as a Novel Target in NRAS Mutant Melanoma

　　

本研究旨在探讨二酰基甘油激酶η（diacylglycerol kinase eta, DGKη）在NRAS突变黑色素瘤中的功能及其作为潜在治疗靶点的可能性。NRAS突变发生于10%–30%的皮肤黑色素瘤中，与较高的肿瘤突变负荷相关。突变NRAS信号通过激活RAF-MEK-ERK1/2激酶通路等途径驱动异常细胞生长和增殖；然而，针对该通路的靶向治疗在NRAS突变黑色素瘤患者中的疗效有限。其他可靶向信号通路在NRAS突变黑色素瘤中的作用尚不清楚。本研究证实，脂质信号调控因子DGKη的一种亚型在二酰基甘油激酶家族中，于NRAS突变黑色素瘤患者样本中呈高表达。在NRAS突变黑色素瘤细胞系中敲低DGKH可显著抑制体外生长。转录组学数据表明，DGKH敲低后雌激素反应晚期特征基因下调，包括CCND1（细胞周期蛋白D1）表达降低。细胞生长抑制与细胞周期蛋白D1表达降低相关，且与DGKH敲低后细胞周期受阻有关。这些数据表明，DGKη介导NRAS突变黑色素瘤细胞的细胞周期进程，并代表该类患者的潜在治疗靶点。

黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，由丝氨酸/苏氨酸激酶原癌基因BRAF和GTP酶原癌基因NRAS的互斥性突变驱动。BRAF突变占黑色素瘤病例的40%–60%，患者可使用美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的BRAF抑制剂和MEK抑制剂进行治疗。NRAS突变占黑色素瘤病例的10%–30%，其中Q61突变最为常见，该亚群患者治疗选择有限、预后差，是领域内的未满足需求。目前尚无FDA批准的针对NRAS突变黑色素瘤的靶向疗法，开发特异性靶向NRAS的RAS抑制剂一直面临挑战。

DGKH基因编码二酰基甘油激酶η（DGKη）同工酶，属于II型二酰基甘油激酶，包含pleckstrin同源（PH）结构域和 sterile alpha基序（SAM）结构域，分别靶向膜磷脂结合和介导蛋白质-蛋白质相互作用。DGKη通过磷酸化二酰基甘油（diacylglycerol, DAG，促生长脂质第二信使）生成磷脂酸（phosphatidic acid, PA，参与膜运输、mTOR激活和应激反应的脂质第二信使），发挥脂质信号开关作用。脂质信号在MAPK和PI3K-AKT-mTOR通路的激活中起关键作用。已有研究表征了DGKα在实体瘤中的促肿瘤活性，包括BRAF突变黑色素瘤；然而，其他DGK同工酶（包括DGKη）在癌症中的作用尚不清楚。

已知DGKη有七种蛋白编码转录本变体，其中两种主要变体为DGKη1和DGKη2。DGKη1（128 kDa）普遍表达于组织中，缺乏SAM结构域，具有催化活性。DGKη2（134 kDa）在C末端含有SAM结构域，通过该结构域形成寡聚体以实现内体定位，表达于睾丸、肾脏和结肠。此前DGKη被报道通过PA产生促进EGFR和KRAS突变肺癌中的肿瘤生长，促进EGF诱导的MAPK通路激活和细胞生长，但其在黑色素瘤中的作用未知。

本研究研究背景在于，DGKη作为分子开关在MAPK和PI3K-AKT-mTOR通路的激活中起关键作用，而这两条通路均参与NRAS突变黑色素瘤的进展和靶向治疗耐药。研究人员旨在阐明DGKη在NRAS突变黑色素瘤中的表达模式及功能意义。

研究人员开展了以下研究：首先，利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）皮肤黑色素瘤（Skin Cutaneous Melanoma, SKCM）Firehose Legacy数据集分析DGK基因家族与NRAS突变的关联；其次，通过RNA干扰技术在NRAS突变黑色素瘤细胞系中敲低DGKH，评估其对细胞增殖的影响；继而通过转录组测序（RNA-seq）分析DGKH敲低后的基因表达变化；采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）鉴定受调控的生物学通路；运用逆转相蛋白阵列（Reverse Phase Protein Array, RPPA）技术分析蛋白水平变化；通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）掺入实验和流式细胞术评估细胞周期进程；通过膜联蛋白V/碘化丙啶（annexin V/proidium iodide, PI）染色及凋亡标志物检测评估细胞死亡情况。研究所用细胞系包括：SKMEL173（NRAS^Q61K）、SKMEL30（NRAS^Q61K）、WM1366（NRAS^Q61L）等NRAS突变细胞系，WM35（BRAF^V600E）作为BRAF突变对照细胞系，以及CHL-1（BRAF、NRAS、NF1三重野生型）细胞系。

研究结果部分：

**2.1 DGKη在NRAS突变黑色素瘤中表达升高**

研究人员通过对TCGA SKCM Firehose Legacy数据集进行分析，发现DGKH转录本每百万（transcripts per million, TPM）与NRAS表达呈强正相关，而与BRAF仅呈中等程度相关。在所有十种DGK同工酶中，DGKH表达与NRAS表达的相关性最为显著（p = 1.55 × 10^?18）。按突变状态分层分析显示，DGKH mRNA在NRAS突变肿瘤（尤其是NRAS^Q61改变样本）中高表达，但在BRAF突变黑色素瘤中无显著升高。蛋白质水平的Western blot分析证实，多数受试NRAS突变黑色素瘤细胞系表达DGKη蛋白，而WM35是唯一表达DGKη的BRAF突变细胞系。这些数据表明DGKH在NRAS突变黑色素瘤（特别是携带NRAS^Q61突变的肿瘤）中表达升高，提示其作为该分子亚群功能研究潜在靶点的价值。

**2.2 DGKH敲低诱导NRAS突变黑色素瘤生长抑制**

研究人员通过RNA-seq分析确定，DGKη1（变体201）是SKMEL173和SKMEL30细胞中主要表达的转录本，且该转录本水平随DGKH靶向siRNA处理而一致降低。Western blot分析显示，敲低后128 kDa和134 kDa条带（分别对应DGKη1和DGKη2）蛋白表达降低。功能实验表明，DGKH敲低显著抑制SKMEL173、SKMEL30和WM1366细胞的生长，而两种独立siRNA均产生类似效应。相反，在BRAF突变的WM35细胞中，DGKH敲低未产生一致的增殖抑制效应；在CHL-1三重野生型细胞中结果不一致。此外，MEK抑制剂曲美替尼（trametinib）处理可导致DGKη蛋白水平剂量依赖性降低，提示DGKη表达至少部分受MAPK/ERK信号调控。综上，DGKη在NRAS突变黑色素瘤细胞系生长中发挥重要作用，且其表达部分受MAPK信号调控。

**2.3 DGKH敲低下调雌激素反应晚期基因**

研究人员对DGKH敲低的NRAS突变细胞进行GSEA分析，发现MYC靶标V1和V2、IL2/STAT5、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、顶端表面以及雌激素反应早期和晚期特征基因集均显著下调。其中，雌激素反应晚期特征基因在两种NRAS突变细胞系中均显著下调。进一步分析该特征基因集中重叠的显著下调基因，发现CCND1（编码细胞周期蛋白D1的关键细胞周期基因）是两种细胞系中均显著下调的九个基因之一，这可能有助于解释观察到的生长抑制效应。这些发现提示DGKη通过维持促增殖转录程序（包括CCND1表达）来促进NRAS突变黑色素瘤细胞增殖，从而支持细胞周期进程。为确定DGKH敲低对NRAS突变信号通路的影响是否为MAPK依赖性或独立性，研究人员通过RPPA和Western blot分析MEK和ERK1/2磷酸化状态，结果未显示一致性改变，提示DGKH敲低可能不改变MEK或ERK1/2信号。RPPA数据还显示细胞周期和生长调控因子（FOXM1、PLK1、细胞周期蛋白B1、磷酸化4EBP1）降低，而存活和受体酪氨酸激酶/Janus激酶-信号转导与转录激活因子（RTK/JAK-STAT）信号因子（IGFRβ、Stat3、Lyn、Pdcd4、Bcl2）升高，这些因子多汇聚于PI3K/AKT信号，提示DGKH敲低可能调节该通路。总体而言，这些数据提示DGKη可能独立于MAPK信号调控细胞增殖。

**2.4 DGKH敲低抑制NRAS突变黑色素瘤细胞周期进程**

研究人员进一步验证RNA-seq数据中CCND1降低是否与生长抑制相关。Western blot显示DGKH敲低后细胞周期蛋白D1（cyclin D1）蛋白水平降低，提示细胞周期受抑。EdU染色和流式细胞术分析证实，DGKH敲低可减少S期进入。同时，annexin V/PI染色、PI摄取实验以及裂解型PARP和caspase-3的Western blot检测均未显示细胞死亡显著增加，表明DGKH敲低不影响NRAS突变黑色素瘤的细胞死亡。这些数据共同表明，DGKH敲低通过损害细胞周期进程而非诱导细胞死亡来抑制NRAS突变黑色素瘤细胞的增殖。

讨论部分总结如下。

NRAS突变黑色素瘤缺乏有效的靶向治疗，本研究将DGKη鉴定为细胞周期调控的脆弱性靶点，其敲低可抑制增殖并诱导细胞周期阻滞。尽管针对NRAS突变黑色素瘤的有效靶向治疗历来有限，但RAS-ON多重抑制剂RMC-7977的最新研究显示了该基因型的临床前和早期临床活性。在此背景下，本研究将DGKη定位为平行的代谢和信号节点，其缺失可破坏NRAS突变黑色素瘤的细胞周期进程和增殖。NRAS突变黑色素瘤常通过获得性PI3K改变和增强的mTOR/S6K信号对MAPK和mTOR通路抑制剂产生耐药，导致患者持久靶向治疗选择匮乏。

DGK同工酶影响多种癌症类型，其中DGKα和DGKζ促进肿瘤细胞生长、存活和G₀/G₁-S期转换，其敲低可抑制增殖并诱导细胞周期阻滞。DGKη在肝细胞癌中被报道为PA驱动的肿瘤代谢调控因子，影响肿瘤干性、mTOR激活和治疗耐药。本研究发现DGKH敲低抑制细胞生长但不降低MAPK信号，RPPA分析鉴定出汇聚于PI3K-AKT信号的多个蛋白改变：IGFRβ和IRS1上调提示增强的上游受体和接头蛋白活性；Lyn增加可通过整合素和Src家族依赖性机制促进PI3K激活；而磷酸化4EBP1降低和Pdcd4增加则与mTORC1输出减弱一致。总体而言，DGKη耗竭改变了PI3K-AKT-mTOR通路的不同节点，而非统一激活或抑制该通路，其调控MAPK/PI3K/mTORC1信号及细胞周期的具体机制有待进一步研究。

本研究的关键局限在于缺乏同工酶选择性药理学DGKη抑制剂，无法直接测试DGKη阻断是否可重现基因敲低效应并使肿瘤对现有靶向治疗敏感。此外，数据库间DGKη转录本注释的不一致性使变体特异性分析复杂化，Western blot中100–115 kDa条带对应的推测无义介导的衰变（nonsense-mediated decay, NMD）DGKη变体有待使用同工酶和变体特异性抗体及蛋白质组学方法进一步验证。曲美替尼部分降低DGKη蛋白水平的数据表明，MAPK/ERK1/2信号调控DGKη表达，但存在额外调控机制。未来研究应开发或应用具有改进同工酶选择性的新兴DGK调节剂，测试与MAPK和mTOR通路抑制剂的联合策略，并明确各DGKη变体如何差异调控PA池、下游mTOR和细胞周期效应子以及治疗反应，同时探索DGKη表达或活性是否可预测临床耐药模式。

研究结论翻译如下：

这些数据共同将DGKη鉴定为NRAS突变黑色素瘤细胞周期进程和增殖的关键调控因子，其功能与其他癌症类型中驱动生长和药物耐药的致癌性DGK家族成员相一致。DGKη并非黑色素瘤增殖的NRAS排他性调控因子，而是可靶向的脆弱性靶点，可扩展NRAS突变疾病的治疗选择。通过填补DGKη在黑色素瘤中生物学理解的空白并突出其对细胞周期控制的影响，本研究支持DGKη作为有前景的治疗靶点，其抑制可能增强现有靶向治疗在NRAS突变黑色素瘤中的疗效。