综述：油棕（Elaies guineensis）与椰子（Cocos nucifera）非转基因基因编辑的潜力

《Plant Breeding》：Potential of Non-GMO Gene Editing for Oil Palm (Elaies guineensis) and Coconut (Cocos nucifera)

　　

精准基因组编辑长期以来一直是植物育种者的重要目标，旨在修饰特定基因而不诱发脱靶效应。围绕这一目标，研究已推动锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及被广泛采用的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统的发展，且该系统近年来又扩展出Cas12和Cas13变体。在作物科学中，这些技术被用于功能基因组学，以阐明基因在生物学机制中的作用，并用于实现除草剂抗性、雄性不育和脂肪酸组成修饰等实际性状改良。棕榈类作物是食品与工业原料的重要来源，但若要提升生产力并增强逆境耐受性，仍需进一步开展遗传改良。近期文献表明，CRISPR/Cas9已成功用于棕榈类植物中敲除EgPDS、EgPTE、EgFAD2和EgPATb等靶基因，显示出其变革性潜力。为充分利用这些进展，仍需系统优化基因组编辑技术流程，并推动Cas12和碱基编辑技术在槟榔等被忽视物种中的应用拓展。

1 Introduction

论文首先指出，棕榈类作物育种亟需对理想株型进行重塑，包括培育矮化树冠、缩短幼年期、提高果实或果穗产量以及改善采收便利性等目标。与此同时，气候变化背景下还需要修饰与生物胁迫和非生物胁迫敏感性相关的位点，以增强不同气候区域中的适应能力。针对油棕与椰子等棕榈作物，产业上还迫切需要提高油分含量并优化果实脂肪酸组成。例如，生物燃料产业偏好高棕榈酸含量原料，而食用油产业则更需要高硬脂酸或高油酸材料。此外，某些棕榈原料还含有抗营养或有毒化合物，如槟榔中的槟榔碱，因而需要通过遗传改良降低其含量。文章认为，这类目标性状往往涉及优异材料与野生种质之间对立等位基因的导入，但由于木本和果树类作物世代周期长、远缘导入困难以及连锁累赘显著，传统育种在消除不良性状方面面临很大障碍。

在传统改良路径方面，论文回顾了诱变育种及其衍生分子技术的应用。诱变育种已被广泛用于改变不良基因，并在部分材料中获得了油脂品质改变或半矮秆等新性状。随着分子技术进步，靶向诱导局部基因组损伤检测（TILLING）等方法能够在已知目标基因序列的前提下，于较小诱变群体中高效识别突变体。与此同时，反义技术与RNA干扰（RNAi）也可用于目标基因表达下调或沉默，适合在特定发育阶段或特定条件下抑制不利基因表达。作者借此引出基因编辑技术相对于传统诱变和转录调控手段的优势，即能够更精准地实现基因敲除、插入或碱基水平修饰。

随后，文章系统介绍了当前主要的基因编辑工具，包括ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9、碱基编辑器（BE）以及TnpB核酸酶系统。CRISPR/Cas9依赖向导RNA（gRNA）实现对靶位点的识别与切割，切口修复后可形成点突变或外源片段插入。TALENs和ZFNs则分别依赖可编程蛋白结构域识别特异DNA序列并诱发双链断裂。碱基编辑器可在不产生双链断裂的条件下实现特定碱基对转换，主要诱导C→T或A→G转换。TnpB系统作为来源于转座子的RNA引导核酸酶，在水稻中已显示出较高编辑效率且脱靶较低。文章强调，这些技术在棕榈作物中的应用总体仍处于起步阶段，目前成功案例仍较有限，尤其是无DNA编辑体系仍需进一步发展。

文章还概述了其他作物中基因编辑的代表性应用，如通过编辑AHAS或ALS获得除草剂抗性，通过编辑病害相关基因提升抗病性，通过TALENs增强抗旱性，通过调控营养利用相关位点提高养分利用效率，以及通过碱基编辑提升油酸含量等。作者借此说明，基因编辑在功能解析和性状改良两方面均具有广泛适用性，并提出未来该技术还可用于调控果实易腐、脱落、矮化、缩短幼年期及提升维生素抗氧化特性等多种目标。

2 What Strategies Have Potential in Palm Crops?

本节围绕棕榈作物中最具潜力的编辑策略展开，认为Cas9、CRISPR-Cas12及高精度BE是当前最有前景的方法。传统路径通常采用携带sgRNA表达盒的质粒载体，经农杆菌（Agrobacterium）介导或基因枪轰击导入细胞，再借助GFP、GUS或DsRed等可视化标记以及潮霉素等抗生素进行筛选。然而，这一路径流程冗长、筛选损耗大，最终获得的材料通常属于转基因（GMO）范畴，受较严格监管限制。

针对农杆菌转化，文章总结了胚性愈伤组织处理中多个关键影响因素，包括菌液光密度（OD）、感染时间、共培养时长、污染程度以及抗生素类型和浓度。研究显示，合理优化OD、乙酰丁香酮浓度、感染时间和共培养时间后，油棕转化效率可有明显提高。但不同研究对最优OD值结论并不一致，说明体系受材料状态、培养条件和菌株差异影响较大。作者指出，OD过低会限制T-DNA转移效率，而OD过高则会加剧宿主应激和细菌污染，导致组织褐变、坏死和再生能力下降。这种由污染和组织损伤引起的再生受阻，是棕榈类GMO开发缓慢的重要原因之一。

文章进一步汇总了油棕中EgFAD2、EgPAT、EgPTE等基因的农杆菌介导编辑结果。已有研究在转化后材料中检测到插入/缺失突变（indels）和移码突变，表明这些目标位点确实可被CRISPR/Cas9有效切割。但总体来看，不同基因和不同体系之间的编辑效率差异显著，且抗生素筛选和愈伤组织再生仍是限制最终编辑效率的关键瓶颈。除了技术问题，作者还指出，含抗性筛选标记的材料在伦理与法规层面也面临较大障碍。

基于此，论文重点提出无DNA的CRISPR-核糖核蛋白复合体（CRISPR-RNP）技术是克服监管与公众接受度问题的重要方向。该技术不向基因组中稳定整合外源基因，因而更符合“非转基因”编辑理念。已有研究已在油棕原生质体和胚性愈伤组织中证实CRISPR-RNP的可行性，显示其在株型改良和幼年期抗逆增强等方面具备应用潜力。

3 Non-GMO Gene Editing Strategies

3.1 RNP Delivery via Gene Gun

本小节聚焦RNP经基因枪递送的策略。既往研究已利用基因枪将质粒导入油棕愈伤组织、体细胞胚和幼苗，并通过优化氦气压力、轰击距离和真空参数获得较高转化率。在RNP体系下，编辑复合体可在细胞外预先组装，无需载体整合即可直接作用于靶位点，因此具有较低脱靶效应、较低细胞毒性和更快速的编辑流程。油棕研究表明，CRISPR-RNP在原生质体中可实现极高编辑效率，在胚性愈伤组织中通过生物弹射导入后，也可在EgPDS多个靶位点产生可检测突变，并显著缩短再生时间。

不过，文章也指出，基因枪法依赖专门设备与金颗粒，成本较高，且物理轰击易引起细胞损伤。为改善递送效果，需要优化钙离子浓度、RNP与颗粒比例及超声分散条件，以减少颗粒聚集并提高均匀性。作者特别强调，棕榈类组织再生能力和木本顽拗性会影响RNP策略成效，因此应优先选用生理状态良好、木质化程度较低的胚性愈伤组织。原生质体因缺乏细胞壁屏障，是提高RNP编辑效率的潜在优选材料。此外，纳米颗粒和碳点等新型递送技术也被认为是未来提升顽拗性物种编辑效率的重要方向。

3.2 RNP Delivery via Pollination

本小节讨论了基于授粉过程的体内递送思路。文章认为，许多基因型在体外培养中的顽拗性和再生限制，促使研究者探索不依赖体细胞胚发生的体内或原位编辑策略。将CRISPR-RNP直接递送至花粉、卵细胞、合子或胚等生殖组织，有望获得可遗传编辑后代。花粉因其单倍体属性，尤其适合作为多年生作物的编辑靶标。已有研究在小麦、大麦、玉米和烟草中，采用基因枪、农杆菌或纳米颗粒向花粉递送编辑组分，并取得一定成功。

论文指出，尽管在部分模式或草本作物中，RNP可经花粉管递送至胚囊并编辑母本等位基因，但在棕榈类中尚需针对花粉活力维持、RNP递送稳定性及T₀代隐性突变获取效率进行专门优化。作者认为，若该路线成熟，将能够绕开体外愈伤组织诱导和植株再生等高难度步骤，对棕榈类非转基因编辑具有显著吸引力。

3.3 Protoplast Gene Editing and Regeneration

本小节集中讨论原生质体编辑体系。聚乙二醇（PEG）介导转化被认为是相对安全且低毒的方法，在油棕和槟榔等棕榈类中已有一定效率报道。通过热激处理、PEG浓度调节、CaCl₂或MgCl₂添加以及启动子筛选，可提高质粒转染效率。进一步地，已有研究将PEG、电转化和脂质体转染用于CRISPR-RNP递送，在其他物种中获得了较高编辑水平。油棕中针对EgPDS和EgBRI1的原生质体转化及编辑已完成技术验证，说明原生质体不仅适于瞬时表达，也可用于实际细胞编辑。

然而，文章明确指出，棕榈类原生质体体系的核心难题并不完全在于编辑本身，而在于原生质体脆弱、转化后快速衰败、群体混杂以及再生极慢。随着PEG浓度或电转强度提高，递送效率虽可提升，但细胞活力会下降。再者，原生质体通常是群体性转染，编辑细胞与未编辑细胞混杂，需要后续筛选；而棕榈类从原生质体到微愈伤组织乃至完整植株的再生常在中途停滞。因此，作者认为，提高棕榈类原生质体分离与再生体系效率，是释放CRISPR-RNP潜力的关键前提。

4 Progress in Oil Palm Gene Editing: Technology Demonstration

4.1 Estimating the Gene Editing Efficiencies in Palm Species

本节总结了棕榈类尤其是油棕中基因编辑效率的技术验证进展。PDS基因由于失功能后可产生明显白化表型，已成为油棕和椰子中最常用的编辑示踪基因。除了PDS，DsRED等荧光标记基因也可作为编辑效率判断依据。油棕中针对EgPDS和EgBRI1的编辑结果表明，不同sgRNA设计、递送方式与材料类型均会显著影响基因敲除效率；EgPDS突变可通过白化表型直接确认，而EgBRI1突变则与矮化生长和叶尖坏死等表型相关。RNP体系在EgPDS上的高效突变进一步证明了无DNA编辑在棕榈中的技术可行性。对于椰子，CnPDS原生质体转化已建立基本平台，虽稳定编辑效率仍不高，但为后续功能基因组学和育种应用奠定了基础。

4.2 Targeting Important Genes Related to Oil Quality in Palm

本小节重点讨论与油脂品质相关基因的定向编辑。降低棕榈酸、提高不饱和脂肪酸含量是油棕改良的重要方向，因此EgFAD2与EgPAT成为关键候选基因。研究中通过组装多个sgRNA并采用PEG介导、基因枪和农杆菌等不同转化途径，对这两个基因进行CRISPR/Cas9编辑。结果显示，PEG介导方式在EgFAD2上获得较高突变率，农杆菌在两个基因上也能实现有效编辑，而基因枪效率相对较低。突变类型包括小片段缺失和较大片段删除，个别材料在EgFAD2位点实现了很高的敲除效率。这些结果说明，通过定向修饰脂肪酸代谢相关位点，棕榈油油酸含量提升具备现实可能性。

此外，PTE基因也被作为提高棕榈酸含量的候选靶点进行编辑。相关研究利用农杆菌处理愈伤组织，并通过预培养和抗生素筛选改善转化效果。文章指出，对于此类基因，CRISPR诱导的碱基添加、缺失或替换既可能增强基因表达，也可能导致基因失活，因此需要在再生植株水平进一步评估其代谢和表型后果。

4.3 Multiplexing sgRNA in Oil Palm

针对复杂性状，文章强调多重sgRNA编辑的重要性。研究中通常依据目标基因外显子序列及PAM上游20 nt区域设计sgRNA，并通过GC含量优化和二级结构规避提升编辑效率。多重编辑可借助Golden Gate克隆策略，将多个sgRNA模块组装进单一载体，从而实现多个油脂生物合成相关基因的同步编辑。作者认为，这一策略对于油脂组成等多基因控制性状尤其关键，也是未来提升棕榈营养品质和工业品质的有效手段。

5 Limitations and Problems

文章在本节系统归纳了当前限制因素。首先，不同目标基因之间编辑成功率差异显著。EgPDS由于表型易判定而常表现出较高可见编辑率，但其他基因受序列特征、基因功能、染色体位置、材料基因型及递送方式影响，效率可能明显降低。其次，复杂农艺性状通常由多个代谢通路基因共同控制，单一基因编辑往往不足以带来显著表型改变，因此必须依赖多重编辑。但随着靶基因数增加，载体构建、递送难度、成本及潜在脱靶风险也同步升高。再次，基因多效性（pleiotropy）构成重要风险，一些目标基因在改良某一性状的同时，可能负面影响产量、器官形态或逆境适应性。因此，编辑材料仍需结合后续选择与育种程序，才能获得兼顾目标性状与农艺表现的优良基因型。

6 Prospective

在前景展望中，作者认为，提高编辑精度、降低脱靶效应并扩大可编辑位点范围是下一阶段重点。Cas12新变体可突破PAM限制，碱基编辑器则可能以较少插入/缺失突变实现更温和的等位变异构建。RNP高效递送仍是核心技术瓶颈，除生物弹射外，脂质体、电转和碳点等递送技术值得进一步优化。未来，棕榈基因编辑不仅应聚焦油脂品质，还应加强对病害抗性、非生物胁迫耐受、养分吸收及耐盐机制相关基因的修饰。作者还指出，编辑性状可能与产量之间存在权衡，因此需要将基因编辑与常规育种结合，通过选择、杂交和无性扩繁实现优良材料固定。同时，环境释放、基因流动、花粉传播、法规协调和公众认知等问题，也将深刻影响该技术从实验室走向应用的进程。

7 From Lab to Farm

在应用转化路径上，论文提出了从实验室到田间的渐进框架。首先，可围绕脂肪酸组成、病原抗性和非生物胁迫耐受等关键育种目标建立突变体库，并通过离体或原位保存维持资源。其次，应在多地点条件下开展试验种植，系统评估编辑材料的产量表现及可能的不良效应。通过后续鉴定，可筛选出兼具优良性状和较高产量潜力的后代，形成新的种质资源。这些新种质可通过体细胞胚发生等组织培养（TC）技术进行真实型扩繁，并最终作为商业化栽培材料或杂交育种亲本用于大规模生产。

8 Conclusion

结论部分指出，基因编辑为棕榈作物育种提供了比传统杂交更快速、也更具定向性的改良路径。现有研究已经在油棕和椰子中验证了EgPTE、EgPAT、EgFAD2、EgPDS和CnPDS等基因的可编辑性，并表明脱靶效应总体较低。尽管棕榈类材料顽拗、递送与再生体系仍待完善，但RNP介导的无DNA编辑已展现出较高效率和较强应用前景。作者最后强调，未来应进一步将Cas12和Cas13等新系统纳入棕榈研究，并澄清“非转基因”编辑在不同国家监管框架下的界定，以推动该技术真正服务于棕榈作物改良与产业发展。