人黑色素瘤中hSOX10近端蛋白质互作组的图谱绘制

《Journal of Proteome Research》：Mapping of the hSOX10 Proximal Protein Interactome in Human Melanoma

　　

转录因子SOX10是黑色素瘤的核心调控因子，影响肿瘤起始、进展、表型可塑性与治疗抵抗，但其功能相关的蛋白质-蛋白质相互作用仍缺乏系统性定义。针对这一问题，研究人员首次在A375黑色素瘤细胞中，采用miniTurbo（mT） proximity-dependent biotinylation结合质谱技术，对人SOX10（hSOX10）近端蛋白质互作组进行了专门且全面的绘制。通过在接近内源性表达水平下构建稳定表达N端或C端mT标记的hSOX10融合蛋白的细胞系，研究人员在天然细胞环境中无偏捕获近端蛋白质，鉴定出847个黑色素瘤富集的候选hSOX10互作蛋白。经严格统计过滤、污染物频率分析与亚细胞定位筛选后，获得180个高置信度候选蛋白，其中包含已知hSOX10互作伙伴及此前未报道的候选分子。进一步整合正交生物学相关性标准（功能富集与网络背景、与hSOX10的转录组共表达、黑色素瘤中的基因组共现性）将数据集精炼至124个生物学相关候选蛋白，这些蛋白富集于转录调控因子、共因子、染色质修饰复合物及相关通路。研究人员在不额外排除的情况下，采用基于证据的分级框架对这些蛋白进行分层，该框架整合了转录组、基因组与染色质相关背景信息。本研究为黑色素瘤中hSOX10近端蛋白质互作组提供了高置信度资源，并为提出关于hSOX10相关调控网络、黑色素瘤生物学及治疗脆弱性的可检验假说奠定了框架。

该研究发表于《Journal of Proteome Research》，针对黑色素瘤中核心转录调控因子SOX10的功能机制不明晰这一科学问题展开。SOX10作为神经嵴起源的谱系决定因子，在黑色素瘤的发生、增殖、表型转换及耐药形成中发挥关键作用，但传统免疫共沉淀等方法难以捕获其瞬时、低亲和力及依赖环境的蛋白质互作，因此研究人员采用miniTurbo（mT） proximity-dependent biotinylation技术，在A375黑色素瘤细胞中对hSOX10的近端蛋白质互作组进行了系统性绘制。研究最终获得124个高置信度的候选互作蛋白，明确了hSOX10位于以染色质重塑和增强子调控为核心的蛋白质微环境，为解析黑色素瘤的可塑性及耐药机制提供了新的资源与方向。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用A375人皮肤黑色素瘤细胞系构建稳定表达N端或C端mT标记hSOX10融合蛋白的细胞模型；通过 proximity-dependent biotinylation标记hSOX10周围10–35 nm半径内的蛋白质，结合链霉亲和素富集与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质鉴定；采用MaxQuant与Perseus软件进行数据预处理与统计分析，结合CRAPome数据库去除亲和纯化常见污染物，并通过人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）注释亚细胞定位；整合基因本体（GO）功能富集、STRING与Cytoscape网络分析、GEPIA2转录组共表达分析及cBioPortal基因组共现分析等多组学证据进行生物相关性筛选与分级。

研究结果分为以下部分：

Generation of hSOX10 Proximity Labeling Constructs and Structural Modeling：研究人员构建了N端mT-hSOX10、C端hSOX10-mT及核定位对照mT-NLS三种慢病毒载体，通过AlphaFold 3预测结构显示mT标签未破坏hSOX10核心功能域（二聚化域DIM、高迁移率族框HMG DNA结合域、转录激活域TAM/TAC）的折叠完整性，且融合蛋白直径约5–15 nm，在mT有效标记半径内可覆盖互补的蛋白质微区。Western blot验证了融合蛋白在A375细胞中的稳定表达及生物素标记活性，确定90分钟为最佳标记时长。

Stable Expression of Fusion Proteins and Optimization of Proximity Labeling：Western blot证实内源性hSOX10表达未受融合蛋白影响，C端融合蛋白表达量高于N端；链霉亲和素印迹显示两种融合蛋白均产生特异性生物素化信号，且随生物素孵育时间延长而增强，排除内源性线粒体羧化酶的背景干扰。

Identification of the hSOX10 Proximal Protein Interactome by Mass Spectrometry and Initial Technical and Statistical Refining Steps：主成分分析（PCA）显示实验组与对照组样本分离良好，C端融合蛋白的肽段检出量显著高于N端及对照。经统计筛选（绝对log₂倍数变化≥2或≤?2、校正p值≤0.05、至少2个独特肽段），从初始1019个候选蛋白中鉴定出847个黑色素瘤富集的候选互作蛋白，其中207个为两种融合方向共有的基因水平可解析候选，剔除共享肽段无法区分的蛋白后保留205个。

Contaminant Frequency and Subcellular Localization Filtering Refine High-Confidence hSOX10 Protein Interactor Candidates：CRAPome分析显示91.3%的共有候选蛋白在无关亲和纯化质谱中的检出率低于40%，已知hSOX10互作蛋白的检出率均低于20%；结合人类蛋白质图谱的核定位注释，最终筛选出180个高置信度核定位候选互作蛋白。

Functional Enrichment Highlights Transcriptional and Chromatin-Regulatory Programs among the Top 180 hSOX10-Proximal Candidate Protein Interactors：STRING与ClueGO分析显示候选蛋白显著富集于转录共调控、DNA结合转录因子、染色质结合等分子功能，以及染色质组织、SUMO化修饰、DNA损伤应答等生物学过程与通路；网络分析揭示了包含SWI/SNF染色质重塑复合物、MLL/COMPASS组蛋白修饰复合物等在内的功能模块，Western blot验证了YAP1、MAML1、TRIM24、KMT2A等候选蛋白的富集。

Transcriptomic and Genomic Integration Identifies hSOX10-Associated Regulatory Candidates in Melanoma：GEPIA2分析显示ARID1A、SMARCA4、BRD4、EP300、MAML1等候选基因与hSOX10在TCGA皮肤黑色素瘤样本中呈强正相关；cBioPortal分析发现KMT2D、BRD4、SMARCA4、EP300及NCOA家族基因的基因组改变与hSOX10改变显著共现，ZFHX4、MECOM、KMT2D、ARID1A、ARID2的突变频率达13%–25%。

Integrated Biological Relevance Filtering and Evidence-Based Prioritization of the hSOX10 Proximal Protein Interactome：研究人员将满足“属于转录/染色质功能模块或存在猎物-猎物互作”“与hSOX10强转录共表达”“与hSOX10基因组改变显著共现”任一标准的候选蛋白保留，最终获得124个生物学相关候选互作蛋白。整合ChIP-Atlas的hSOX10染色质结合数据，所有候选均在泛癌数据集中存在结合证据，其中113个在葡萄膜黑色素瘤数据集中存在结合证据。基于5项正交标准（功能支持、转录共表达、基因组共现、泛癌ChIP结合、黑色素瘤ChIP结合）的分级显示，半数以上候选满足3项标准，21.8%满足4项，8.1%满足全部5项。

讨论部分指出，该研究首次系统性定义了hSOX10的近端蛋白质互作组，尽管SOX10在黑色素瘤中较少发生突变，但其通过非突变机制（表达改变、增强子重编程、翻译后修饰、共因子结合变化）驱动肿瘤进展。研究明确hSOX10并非独立发挥作用，而是位于以染色质重塑复合物（如SWI/SNF的ARID1A、SMARCA4等）、MLL/COMPASS组蛋白修饰复合物（KMT2A、KMT2C、KMT2D）、转录共调控因子（EP300、NCOR2）、染色质架构因子（NIPBL）及抑制性复合物（MiDAC、G9a/GLP）为核心的调控枢纽中，这些组分共同协调染色质可及性、增强子活性与三维基因组组织，进而调控黑色素瘤的细胞状态与适应性。研究同时指出局限性：仅在BRAF^V600E突变的皮肤黑色素瘤模型中开展，且邻近标记无法区分直接结合与间接关联，需后续正交验证。

研究结论部分表明，本研究通过miniTurbo proximity-dependent biotinylation联合质谱技术，首次绘制了人黑色素瘤中hSOX10的近端蛋白质互作组，获得124个高置信度候选互作蛋白，包含已知互作伙伴及新型候选分子，这些蛋白富集于转录调控、染色质重塑、增强子相关复合物及翻译后调控机制。该研究将hSOX10定位于支持黑色素瘤细胞身份与可塑性的染色质中心调控微环境，为深入探究hSOX10依赖的转录程序及黑色素瘤等hSOX10依赖性疾病的治疗靶点提供了可靠的假设生成资源。