用于活体跨尺度成像的多模态自适应光学显微镜

《Nature Methods》：A multimodal adaptive optical microscope for in vivo imaging from molecules to organisms

　　

理解生物系统需要跨越从纳米到厘米、毫秒到天的时间与空间尺度，观测特征与动态过程，这通常需在复杂天然微环境中联合多种成像模态。然而，现有显微镜因光学设计与样品适配的固有取舍，往往难以兼顾多功能需求，且在多细胞样本中易受样品诱导的光学像差影响，导致性能下降。为此，研究人员开发了集成自适应成像校正的多模态光学显微镜（Multimodal Optical Scope with Adaptive Imaging Correction, MOSAIC）。该仪器可重构切换光片显微术、无标记成像、超分辨率显微术及多光子显微术等多种先进成像模式，均配备自适应光学（Adaptive Optics, AO）模块。MOSAIC实现了培养细胞与活体多细胞生物的亚细胞动态无创成像、毫米级膨胀组织的分子结构纳米尺度图谱绘制，以及活体小鼠的结构与功能神经成像。其支持在同一标本内开展跨生物尺度的关联研究，为广泛的生物学探索提供了集成化平台。

研究背景与意义

生命科学研究长期依赖光学显微镜揭示从单分子动力学到整体生物体发育的过程，但传统显微镜多为单一模态优化设计，存在光学性能、样品适配性与操作复杂度的固有权衡。例如，高数值孔径物镜牺牲视场与工作距离，光片显微镜需特殊样品装载，双光子成像则受限于速度与多色能力。此外，商用显微镜普遍忽略多细胞样品诱导的光学像差问题，导致深层成像性能急剧下降。针对这些瓶颈，研究人员开发了多模态光学显微镜MOSAIC，通过硬件复用与自适应光学校正，实现单台仪器覆盖从分子到生物体的跨尺度成像，显著降低设备成本与操作复杂度，相关成果发表于《Nature Methods》。

关键技术方法

研究人员采用可重构光路设计，整合七色可见光与可调谐飞秒激光光源，通过空间光调制器（Spatial Light Modulator, SLM）生成多模态激发图案，结合变形镜（Deformable Mirror, DM）与夏克-哈特曼波前传感器实现双通道自适应光学校正。仪器搭载倒置与直立两套样品站，支持25 mm直径盖玻片样品与活体小鼠成像，环境舱可实现温度、灌注与CO₂精准控制。数据采集由自主开发的LabVIEW软件控制，图像处理依托GPU加速的PetaKit5D pipeline完成。样本涵盖培养细胞系、斑马鱼胚胎、果蝇、线虫、人类脑类器官及阿尔茨海默病患者海马组织切片。

研究结果

显微镜设计与表征

MOSAIC基于晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy, LLSM）架构升级，采用0.6 NA激发物镜与1.0 NA探测物镜组合，将工作距离从近零提升至330 μm，支持更大样品装载与全视场扫描。通过二向色镜堆分光与SLM独立相位调控，实现七色同步多色成像，光片体积成像速度较原系统翻倍。仪器可在2–5秒内切换光片显微术、斜照明、宽场结构光照明显微术（Structured Illumination Microscopy, SIM）、图像扫描显微术（Image Scanning Microscopy, ISM）及双光子点扫描等模式，所有模式均集成自适应光学校正。

大视场培养细胞长时程多模态成像

研究人员利用晶格光片模式对LLC-PK1细胞系进行24小时连续三维成像，每90秒采集一次，覆盖1×0.75 mm²视场，获得包含约150万核图像体积的49 TB数据集。观测到典型有丝分裂事件及罕见的三极分裂现象，并追踪到子代细胞的凋亡过程。结合无标记斜照明（Oblique Illumination, OI）模式，实现高达100 Hz的二维动态成像，捕捉到细胞膜褶皱与细菌分裂事件，并通过拼接成像覆盖1.2×1.0 mm²视场，监测大规模细胞迁移与分裂。

多模态观测与光遗传学扰动

MOSAIC支持同一采集中交替切换晶格光片与斜照明成像，在单个细胞内关联线粒体三维重塑与细胞膜形态变化。结合点扫描光遗传刺激模块，研究人员在hTERT-RPE1细胞中成功诱导Rac1蛋白激活，引发肌动蛋白聚合与膜褶皱，验证了多模态联用对细胞动态过程的精准操控与观测能力。

活细胞多模态超分辨率成像

研究人员集成单分子追踪（Single-Particle Tracking, SPT）、图像扫描显微术与三维结构光照明显微术，实现活细胞多尺度超分辨率成像。在小鼠胚胎干细胞中，以25 nm定位精度追踪SOX2转录因子分子的扩散动力学，鉴定出DNA结合态与自由扩散态两种运动模式。通过晶格光片结构光照明显微术（LLS-SIM）以180 nm横向分辨率，连续观测内质网与高尔基体的动态互作超过1小时。三维结构光照明显微术则以57秒间隔对线粒体与高尔基体进行10.7小时长时程成像，捕捉到细胞器裂变、融合与运输事件。

大视场三维超分辨率结构成像

利用DNA-PAINT技术，研究人员在180×200×17 μm³体积内以16 nm侧向定位精度解析核膜与线粒体外膜的纳米结构，发现线粒体穿过核膜内陷的特殊形态。结合膨胀显微术（Expansion Microscopy, ExM），对阿尔茨海默病患者海马组织切片进行4倍膨胀后成像，覆盖2×2.4×0.1 mm³区域，揭示髓鞘气球样变、神经纤维簇状聚集等病理特征，证实大视场纳米成像对组织异质性研究的价值。

自适应光学晶格光片在活体生物中的应用

研究人员在斑马鱼移植瘤模型中，通过自适应光学校正恢复衍射极限分辨率，观测到乳腺癌细胞沿血管迁移与外渗过程中血管壁的撕裂现象。在斑马鱼尾鳍再生模型中，以3分钟间隔连续成像12.5小时，捕捉到伤口附近细胞外囊泡分泌、基底膜锚定纤维重塑及间充质细胞融合等亚细胞事件。利用细胞周期依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinase, CDK）活性传感器，量化尾芽区细胞周期状态的空间分布差异。

斑马鱼活体自适应光学超分辨率成像

针对组织像差对超分辨率重建的干扰，研究人员在斑马鱼胚胎眼与脑区应用自适应光学辅助的LLS-SIM，恢复光栅调制对比度，实现线粒体形态与分布的精准分割。对于不适合双物镜成像的较大样本，采用单物镜图像扫描显微术结合自适应光学校正，在7天龄斑马鱼幼鱼中观测到神经丘器官内的细胞迁移动态。

活体组织自适应光学双光子成像

在活体小鼠皮层成像中，研究人员通过每25 μm深度独立校正像差，在400 μm深度范围内实现树突棘单颗粒分辨率。功能成像显示，自适应光学校正使钙瞬变检测灵敏度提升约2.5倍，在相同时间内检测到更多树突棘钙活动事件。双色双光子成像同时可视化血管网络与树突分支，并追踪毛细血管内红细胞流动。

讨论与结论

MOSAIC通过硬件复用与自适应光学集成，突破了传统显微镜单一模态的性能局限，降低了多模态成像的设备与运维成本，支持同一样本内的跨尺度关联研究。尽管仪器操作复杂度较高，但可根据研究需求定制功能模块。目前已有十余个研究团队使用该平台，产出多项技术与生物学成果。伴随数据量激增（每小时可达4 TB），研究人员正开发基于机器学习的三维/四维基础模型以处理海量数据，并提议建立类似天文台的“细胞观测中心”，提供集中式显微成像、高性能计算与专家支持，推动细胞生物学核心原理的解析。该研究证实，多模态自适应光学显微镜是实现从分子到生物体活体成像的有力工具，为生命科学多尺度研究提供了通用技术平台。