《Small Science》：Entry Without Expression: Internalisation Does Not Predict mRNA Translation for Targeted Lipid Nanoparticles
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脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）递送系统可高效封装并保护mRNA，已成为核酸药物（包括mRNA疫苗）的主流平台。传统LNP依赖非特异性细胞互作与内化，易导致靶细胞递送效率低及脱靶效应。通过在LNP表面修饰抗体可增强靶细胞富集并减少
脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）递送系统可高效封装并保护mRNA，已成为核酸药物（包括mRNA疫苗）的主流平台。传统LNP依赖非特异性细胞互作与内化，易导致靶细胞递送效率低及脱靶效应。通过在LNP表面修饰抗体可增强靶细胞富集并减少脱靶，但仅依据受体丰度筛选抗体-受体组合无法实现最优递送。研究人员开发了一种新方法，可在原代人T细胞和B细胞中定量抗体功能化LNP/mRNA的内化效率与mRNA递送效率。通过靶向一系列临床相关T细胞和B细胞受体，研究发现LNP内化并不必然带来成功的mRNA递送。结果表明，受体介导的内化可改善LNP靶向递送，但受体特异性的内化后运输路径对LNP/mRNA成功进入胞质并翻译至关重要。
《Small Science》发表的这项研究针对LNP介导的mRNA靶向递送中“内化即有效”的认知局限展开深入探究。当前，LNP已在COVID-19 mRNA疫苗中实现成功应用，但其多数仍依赖被动分布与低效摄取机制，限制了在非疫苗领域的精准应用。抗体修饰虽可提升靶向性，但既往筛选策略多聚焦于受体表面丰度，忽略了内化后过程对药效的决定性作用。为突破这一瓶颈，研究人员构建了高通量抗体偶联LNP筛选平台，结合新型内化定量技术，在原发性人类外周血单个核细胞（PBMCs）中系统比较了不同淋巴细胞受体靶向LNP的细胞互作、内化效率与mRNA翻译输出的关系，明确了内化后运输而非单纯内化事件是决定蛋白表达的关键，为理性设计下一代靶向LNP提供了量化依据。
为开展研究，研究人员采用了几项核心技术：一是开发了位点特异性抗体捕获系统，利用抗Fc纳米抗体（anti-Fc nanobody, anti-FcNb）将单克隆抗体定向偶联至LNP表面，避免了传统随机偶联的纯化步骤并提升了蛋白表达效率；二是建立了特异性杂交内化探针（Specific Hybridisation Internalisation Probe, SHIP）检测体系，通过荧光标记单链DNA偶联抗体，结合膜不透性淬灭剂区分细胞表面结合与胞内内化信号，实现内化效率的精准量化；三是采用原代人PBMCs作为生理相关性样本，通过流式细胞术同时检测LNP内化信号与报告mRNA（编码mScarlet红色荧光蛋白）的翻译输出，实现对不同受体靶向LNP的多参数平行评价。
研究主体结果如下：
2.1 用于内化筛选的FIP-mAb-LNP开发
研究人员将SHIP检测体系整合至anti-FcNb-LNP平台，通过点击化学将Cy5标记的荧光内化探针（Fluorescent Internalisation Probe, FIP）偶联至靶向抗体，再经Fc段捕获固定于LNP表面。该体系可同步测量LNP的细胞关联、内化效率及mRNA翻译产生的蛋白表达，且无需对每批次抗体-LNP单独表征，实现了跨靶点的制剂一致性。
2.2 靶向主要B细胞和T细胞标志物的FIP-mAb-LNP内化研究
选取5种临床相关抗体（靶向CD3、CD7、CD20、CD22、CD45）及同型对照，在健康供者PBMCs中孵育4小时。通过设定关联信号显著性阈值，排除了非特异性结合干扰，确保内化效率计算的生物学意义，聚焦受体特异性内化行为。
2.3 B细胞中CD22靶向LNP内化效率高但报告蛋白表达低
在B细胞中，CD22靶向LNP的总关联与内化效率（>70%）均显著高于CD20（~34%）和CD45（<1%）靶向组。然而，CD22组的mScarlet表达水平与CD20组相当，CD45组则几乎无表达。通过计算表达效率（mScarlet MFI/内化Cy5 MFI），发现CD20靶向LNP的表达效率约为CD22组的9倍。这表明CD22作为内吞循环受体，可能将LNP快速转运至再循环途径，不利于mRNA从内体逃逸至胞质；而CD20内化较慢，延长了LNP在晚期内体的滞留时间，促进了mRNA释放。
2.4 T细胞中CD3靶向LNP蛋白表达更高效，尽管内化效率较低
在CD4+T细胞中，CD7靶向LNP的内化效率（~90%）显著高于CD3靶向组（~55%），但CD3组的mScarlet表达量是CD7组的近2倍。表达效率计算显示，CD3靶向LNP的mRNA翻译效率约为CD7组的3倍。CD45靶向LNP在两群T细胞中表达效率均极低。这可能与CD3受体交联后可激活T细胞信号通路，增强胞内蛋白合成机制活性有关，体现了受体信号功能对mRNA翻译的调控作用。
讨论与结论
研究证实，LNP的细胞靶向能力与内化效率均不是预测mRNA翻译产出的可靠指标。受体介导的内化后运输路径（如内体逃逸效率、再循环速率）及受体交联引发的下游信号（如T细胞活化）共同决定了最终蛋白表达水平。因此，筛选靶向LNP的最优受体必须超越表面丰度与内化率的单一维度，综合评估其细胞内运输命运。SHIP检测体系为解析LNP细胞加工过程、指导理性选择抗体靶点以提升治疗性LNP的靶细胞积累与蛋白表达提供了关键工具，将推动精准核酸药物的开发。
