用于原生条件下细菌-纳米柱（Nanopillar）界面成像的冷冻聚焦离子束提取（Cryo-FIB Lift-Out）与电子断层成像（Electron Tomography）工作流程：研究蜻蜓灵感杀菌钛表面

《Small Methods》：Cryo-FIB Lift-Out and Electron Tomography Workflow for Bacteria–Nanopillar Interface Imaging Under Native Conditions: Investigating Dragonfly Inspired Bactericidal Titanium Surfaces

　　

受蜻蜓和蝉翼启发的钛纳米结构表面表现出良好的杀菌性能。然而，目前如何在水合条件下直接可视化细菌与材料界面的研究仍然有限，这限制了实验对细菌如何与纳米结构表面相互作用的探究。这一局限反映了长期存在的方法论空白，因为细菌-纳米结构界面的可视化主要依赖于间接或脱水成像方法。冷冻电子断层成像（cryo-ET）能够在原生水合环境中实现细胞超微结构的三维可视化，但通过cryo-ET对附着在金属纳米结构上的细菌进行成像，需要制备薄的电子透明切片（Lamellae）。从附着在钛基底上的玻璃化细菌中获得此类切片在技术上具有挑战性，因为冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削必须同时切割软生物材料和硬金属，而且嵌入玻璃态冰中的细菌无法直接可见。研究人员在此建立了一个相关冷冻工作流程，能够对确定的细菌-纳米柱界面进行靶向提取和cryo-ET成像。首先通过相关冷冻荧光显微镜识别与钛纳米柱相互作用的单个细菌，随后进行靶向cryo-FIB提取（Lift-Out），转移至接收网格，并减薄为电子透明切片。所展示的数据证明，细菌-纳米结构界面可以在完全水合条件下进行靶向、提取和原位结构分析。该工作流程为未来细菌-纳米形貌相互作用的cryo-ET研究提供了方法论框架。

该研究发表于《Small Methods》，旨在解决生物仿生纳米结构表面杀菌机制研究中长期存在的方法学空白。抗菌素耐药性（AMR）的上升是全球重大健康威胁，推动着预防医用植入物细菌感染的创新策略需求。受蜻蜓和蝉翼启发的仿生纳米结构表面是颇具前景的解决方案，研究表明附着在这些表面的细菌细胞会失去活性，但关于这些自然启发纳米结构介导杀菌作用的具体机制尚缺乏全面理解。目前的限制主要源于缺乏能在原生水合状态下捕捉细菌-材料界面的合适成像方法。常规技术如扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和荧光显微镜各有局限：SEM无法捕捉关键的交互界面，TEM需要薄样品且难以观察整个细菌与纳米柱的相互作用，荧光显微镜缺乏纳米级分辨率，且多数现有超微结构证据依赖于化学固定、脱水和树脂包埋样品，可能引入远离原生状态的伪影。因此，研究人员迫切需要能在原生水合状态下保留细菌-材料界面的成像方法。

为克服上述挑战，研究人员建立了一套相关冷冻显微镜工作流程，整合了冷冻荧光显微镜、cryo-FIB提取和冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM），以在接近原生、完全水合状态下表征受蜻蜓翼启发的钛纳米结构表面上的细菌-纳米柱相互作用。该途径消除了传统电镜方法所需的固定和脱水要求，为补充计算模型和优化医用植入物自然启发抗菌表面设计提供了原生状态界面数据的新机会。该相关冷冻显微镜工作流程整合了互补的成像和微加工技术（均在冷冻条件下进行）：冷冻玻璃化（Cryo-vitrification）通过快速固化周围液体将细菌保持在完全水合、化学未受扰动的状态；冷冻荧光显微镜定位纳米结构表面上玻璃化样品中的单个细菌（这是靶向下游处理的关键步骤，因为细菌在cryo-FIB中不可见）；cryo-FIB提取包含细菌-纳米柱界面的确定体积，然后减薄为在冷冻温度下保持的电子透明切片；最后，cryo-ET在完全水合条件下以纳米级分辨率可视化界面，无需常规TEM所需的重金属染色。这一冷冻相关流程使得此前无法实现的细菌-纳米结构相互作用的靶向结构探究成为可能，并为未来细菌与生物启发抗菌表面相互作用的研究提供了方法论框架。

研究人员使用的主要关键技术方法包括：通过热氧化法在钛（Ti-6Al-4V）合金上制备纳米柱（Nanopillar）表面；使用大肠杆菌（Escherichia coli K12）作为模型菌株，并在钛基底上进行接种孵育；采用投入式冷冻（Plunge Freezing, PF）和高压力冷冻（High-Pressure Freezing, HPF）两种方法对样品进行冷冻玻璃化（Cryo-vitrification）处理；利用Leica EM Cryo CLEM Thunder Imager系统进行冷冻光镜（Cryo-LM）成像以定位目标细菌，并使用SYTO9染色细菌DNA；通过Ga-FIB（Tescan AMBER）和Xe等离子体FIB（Tescan AMBER X2）双束系统进行冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryo-FIB-SEM）下的 trench 铣削、粗抛光、块体提取（Slab extraction）及最终减薄，并结合冷冻纳米操纵器（Cryo-nanomanipulator）进行提取转移（Lift-Out）至TEM网格；最后使用Jeol JEM-F200冷冻透射电镜（cryo-TEM）配合SerialEM软件进行倾斜系列（Tilt-series）数据采集和断层成像重构。

研究结果如下：

3.1 通过热氧化生成钛纳米柱：热氧化方法成功生成了研究所用的纳米柱样品。经过丙酮初始处理后样品呈黑色，氧化后呈黄/蓝色。样品整体外观平坦，但表面由高密度纳米柱组成，侧视图显示其并非平坦。

3.2 相关挑战：靶向和隔离单个细菌及块体（Slabs）存在若干困难。Ga-FIB-SEM在提取块体时造成困难，速度较慢，且在铣削钛基底时引起严重再沉积（Redeposition），导致提取效率不高，常使操纵器与块体分离。Ga-FIB铣削速率相对较慢，样品存储至下一会话时有时会导致块体周围冰污染。等离子体FIB-SEM提取的切片在转移至TEM网格时曾发生附着不良。若在TEM切片制备后发生冰污染，样品则无法使用。

3.3 水合状态下细菌-纳米柱界面的可视化：利用该冷冻显微镜工作流程，研究人员证明可以在无需化学固定、脱水或树脂包埋的情况下，原位识别、靶向并成像确定的细菌-纳米柱界面。纳米柱和细菌细胞壁清晰分辨，界面区域充满介质且无可见气隙。有意靶向了附着在表面的细菌，但在纳米柱尖端和细菌细胞壁之间可见100–200 nm的间隙。初始荧光筛选无法分辨纳米柱，妨碍了FIB铣削前直接接触点的明确识别。该数据集确立了细菌-纳米结构表面界面在原生气合条件下可通过冷冻显微镜研究，为未来旨在机制探究杀菌作用在纳米结构表面的研究提供了方法论基础。

在讨论部分，研究人员指出，本研究的主要目标是建立一个相关冷冻显微镜工作流程，使得能够在完全水合条件下靶向提取和直接结构表征细菌-纳米柱界面，从而解决该领域长期存在的方法论空白。cryo-ET数据作为原理验证，而非特定杀菌机制的证据或反证。该工作流程成功实现了在接近原生的水合条件下，靶向特定细菌与临床相关钛基底上纳米柱表面相互作用的cryo-ET流程。与常规室温制备或网格附着细胞的cryo-ET相比，这种基于基底的原位工作流程避免了对细胞的进一步操作（如从原始接触点移除细胞或纳米柱）或使用改变细菌细胞壁的化学固定，能忠实保留细菌-材料界面并以纳米级分辨率分析。尽管在非标准cryo-EM基底和跨地域分离的冷冻显微镜设施下工作存在挑战，但研究表明通过适当的方法适应，可实现细菌-材料界面的高分辨率结构分析。所述工作流程可使用市面可用的冷冻基础设施完全复现，并可适应多种细菌菌株和表面形貌。模块化的工作流程（包括冷冻兼容穿梭系统、转移站和相关策略）允许集成到现有cryo-EM管线中。数据集来自通过完整工作流程的样品，作为方法论概念验证，捕捉了冷冻时刻界面的玻璃化快照，并不打算完全解析细菌粘附或膜变形的时间动态。虽然工作流程技术可行，但可重复性仍取决于样品和操作员，在铣削效率、提取可靠性及相关精度方面存在显著挑战。多设施运输中的冰污染和切片转移期间的静电问题是影响总体产率的重要瓶颈。每一步重新安装和转移都面临冰污染引入或手动处理导致样品完全损失的风险。

结论部分总结：总之，本研究建立了一个稳健的冷冻工作流程，用于直接在金属基底上调查水合条件下的细菌-纳米柱界面。通过结合相关冷冻荧光显微镜与靶向cryo-lift-out，研究人员使得能够从与钛纳米柱表面相互作用的玻璃化细菌中，位点特异性制备电子透明切片。该工作流程为细菌-材料相互作用的原位、高分辨率分析提供了新机会，并为在原生气合状态下研究杀菌纳米形貌及其他生物界面的机制基础提供了一个广泛适用的平台。