纳米抗体（Nanobodies）是源自骆驼科重链仅含重链抗体（HCAbs）的单域抗原结合片段。其分子量小（约12–15 kDa）、溶解度高、稳定性良好且具备抗原结合能力。这些特性有助于识别常规抗体难以到达的表位、改善特定情况下的组织渗透，并支持在可能挑战传统抗体的条件下维持检测性能。近年来，纳米抗体已成为诊断应用中多功能的分子识别工具，并被整合到多种检测平台中，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、侧向层析免疫分析（LFIAs）、生物传感器以及体内成像技术，如正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和纳米抗体-量子点偶联物。多价设计、位点特异性偶联和优化表达系统等进展进一步提升了纳米抗体在临床诊断中的性能。研究人员在此综述中总结了纳米抗体诊断技术的最新进展，概述了有助于其功效的关键结构和生化特征，回顾了正在进行的临床试验，并强调了成功的技术发展。此外，研究人员还讨论了旨在创建可扩展、灵敏且可即时应用的纳米抗体诊断平台的新兴策略。
## 2 纳米抗体相较于传统单克隆抗体（mAb）的结构特征
纳米抗体源自骆驼科HCAbs的VHH结构域，缺乏轻链和重链的CH1结构域。这种简化的架构使其分子尺寸显著小于传统抗体，为诊断应用带来多项优势。VHH结构域保留独立的抗原结合能力，并可作为最小的天然完整抗原结合片段在大肠杆菌、酵母等异源系统中进行重组表达。骆驼科HCAbs的抗原结合位点常由延长的CDR3环塑造，有利于识别传统抗体难以触及的凹陷或裂隙样表位。此外，VHH通常具有特征性的FR2取代、显著的种系多样性以及由V(D)J重组和体细胞高频突变塑造的进一步多样化；部分VHH在抗原结合环之间还含有额外的二硫键。纳米抗体的高热稳定性与其结构特征相关，包括框架适应性、CDR3-框架相互作用以及额外的二硫键；研究表明，通过筛选含有第二对二硫键的变体和在特定框架位置引入稳定化突变可进一步提高其热稳定性。纳米抗体框架的亲水性促进高溶解度并减少聚集，而许多纳米抗体对蛋白酶和pH变化的抵抗力则支持其在多种检测和储存条件下的性能。
## 3 纳米抗体文库构建与筛选策略
获取和构建含有理想纳米抗体基因库的高质量文库对于获得高特异性和高亲和力的纳米抗体至关重要。目前主要使用三种文库类型：免疫文库、天然文库和合成文库（包括半合成形式）。
**3.1 免疫文库**
免疫文库通常通过反复注射含佐剂的靶抗原免疫骆驼科动物4–8周（约6周为常见方案），在末次加强免疫后数天分离外周血单个核细胞（PBMC）或外周血淋巴细胞来构建。免疫原用量通常为每次50–200 μg，以重组蛋白为优。多数方案在末次免疫后3–4天采集50–100 mL血液。高质量文库通常力求至少10
7个独特转化子以确保对成熟免疫库的全面覆盖。研究人员还可利用转基因啮齿动物平台在体外产生HCAb反应，如Janssens等人报道的杂交羊驼/人HCAb基因座转基因小鼠，以及Koch-Nolte团队开发的LamaMouse等系统，均可作为特异性纳米抗体的直接来源。
**3.2 天然与合成文库**
天然纳米抗体文库可获得纳摩尔级亲和力的结合物，证明无需预先免疫即可获得抗原特异性结合物。由于缺少体内靶向免疫，通常需要较大体积血液以获取足够B淋巴细胞，且文库需尽可能大而多样化。噬菌体展示和核糖体展示是筛选天然文库的两种主要方法：前者应用广泛但受细菌转化效率限制，后者作为无细胞平台更适合超大型文库但技术复杂性更高。总体而言，从天然文库分离的纳米抗体初始亲和力通常低于免疫文库，常需要后续的体外亲和力成熟。
半合成或合成纳米抗体文库提供了更有优势的替代方案。这些文库中的所有筛选步骤均在体外进行，实验条件可控且操作简便。为产生针对特定抗原的足够多样化文库，合成/半合成文库构建通常依赖CDR序列的部分随机化来模拟骆驼科动物体细胞高频突变引入的多样性。代表性例子包括Zimmermann等人开发的sybody文库（包含凹面、环状和凸面三种合理设计的格式）以及McMahon等人建立的完全体外酵母表面展示平台。然而，由于缺少免疫诱导的体内亲和力成熟，筛选出的候选物可能表现出较低亲和力，可通过体外亲和力成熟技术增强。目前，合成/半合成纳米抗体文库的设计主要基于羊驼源纳米抗体序列，因其具有较高的熔解温度（Tm），提示更优的热耐受性和更广泛的应用性。
## 4 面向特定应用的纳米抗体格式设计与工程化改造
纳米抗体可基于其单域结构灵活改造为单价、多价、双特异性或多特异性以及融合蛋白等多种格式。
**4.1 单价纳米抗体**
单价VHH（~12–15 kDa）减少整体分子尺寸和潜在空间位阻，同时在没有轻链和CH1结构域的情况下保持完全抗原特异性。其简单结构通常具有良好的溶解度、热稳定性和抗变性能力，在大肠杆菌或酵母系统中表达产量高，对即时诊断和现场部署检测尤为重要。与多价构建体相比，单价VHH缺乏亲和力和再结合效应，因此通常表现出更快的表观解离（更高的表观k
off）和更短的目标驻留/保留时间，这可能影响检测灵敏度，常通过信号放大、多功能报告分子/酶融合以及优化的捕获/固定化策略来缓解。
**4.2 多价纳米抗体**
通过基因串联融合、支架展示或纳米颗粒呈递生成的多价纳米抗体构建体可将内在特异性转化为高亲和力试剂，增加对多价抗原的功能亲和力、驻留时间和分析灵敏度。多价构建体在侧向层析分析、生物传感器等特定平台中可显著降低检测限；在呼吸道病毒的侧向层析免疫分析中，多价设计可稳定金纳米颗粒偶联物并增强色谱迁移和信号强度。
**4.3 双特异性/多特异性纳米抗体**
双特异性和多特异性纳米抗体格式可同时参与两个或多个抗原或表位。其中双表位（biparatopic）格式中，两个连接的VHH识别同一抗原上的不同非重叠表位，在表位间距、结构域取向和连接子结构有利时，可增加亲和力、减缓解离并改善目标捕获。双特异性报告分子设计还可将靶向纳米抗体与针对标签或表面组分的第二结合模块组合，简化检测组装并在多重或信号增强格式中改善报告分子取向。
**4.4 功能增强的纳米抗体融合格式**
Fc融合是最成熟的例子，将VHH与IgG Fc结构域基因连接产生二聚体分子，具有更高的表观结合强度、与标准抗Fc检测试剂的兼容性，以及在某些情况下通过FcRn介导的回收延长的血清存留时间。报告分子融合是另一广泛应用的策略，包括与荧光蛋白或酶的基因融合；纳米抗体-HRP融合已应用于竞争性或夹心ELISA格式，用于A型抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原以及食源性目标如金黄色葡萄球菌α-溶血素、恩诺沙星和赭曲霉毒素A等的检测。此外，纳米抗体还可纳入下一代递送系统，如纳米颗粒基制剂和腺相关病毒（AAV）载体，从而提高递送效率并增强靶向精度。
## 5 纳米抗体的诊断应用
**5.1 体外诊断应用与使能技术**
纳米抗体体外诊断已成为抗原检测、生物标志物定量和即时检验的多功能平台，可增强多种诊断平台的分析灵敏度和特异性。纳米抗体已用于检测军团菌、乙肝病毒（HBV）核心抗原等病原体衍生抗原；与电化学免疫传感器和侧向层析免疫分析结合用于SARS-CoV-2检测；还可靶向癌胚抗原（CEA）等生物标志物用于癌症诊断。
**5.1.1 酶联免疫吸附测定**
纳米抗体靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的标准双抗体夹心ELISA中，定量ELISA为监测生物制造过程中的刺突蛋白水平提供了实用工具。在竞争性ELISA中，纳米抗体已用于检测抗呼吸道综合征病毒抗体。纳米抗体与纳米酶的结合可进一步增强免疫分析的特异性和灵敏度，链霉亲和素作为连接子可改善纳米抗体整合ELISA格式的性能。在食品安全检测方面，新型纳米抗体NbM4已用于开发检测乳制品中黄曲霉毒素M1（AFM1）的间接竞争性ELISA。
**5.1.2 电化学发光免疫分析**
电化学发光免疫分析（ECLIA）利用特异性抗原-抗体相互作用，包括直接、竞争和夹心三种基本格式。钌（II）配合物（特别是联吡啶类物种）是广泛使用的ECL发射体。纳米抗体-ECL免疫传感器使用CdTe量子点包覆二氧化硅纳米颗粒作为信号放大器，以高特异性和灵敏度检测人降钙素原。纳米抗体与ECL标签结合已用于检测DNA杂交，为识别疾病相关DNA序列（如囊性纤维化）提供有力方法。
**5.1.3 荧光免疫分析**
纳米抗体已整合到直接荧光分析、荧光酶免疫分析（FEIA）、荧光夹心免疫分析、比率荧光免疫分析、荧光侧向层析免疫分析和基于微球的多重荧光免疫分析等多种格式中。例如，PPV-VP2特异性纳米抗体-EGFP融合蛋白可实现直接荧光检测；纳米抗体-碱性磷酸酶融合构建的FEIA用于SARS-CoV-2刺突蛋白检测；抗CEACAM-5检测通过双特异性纳米抗体作为捕获试剂、FITC标记的五聚体纳米抗体作为检测试剂得以增强。SARS-CoV-2核衣壳和受体结合域抗原的多表位纳米抗体夹心荧光侧向层析免疫分析使用时间分辨荧光微球，检测限分别达到12.01 pg/mL和6.51 pg/mL，灵敏度高于相应的双单克隆抗体格式和商业抗原检测。
**5.1.4 侧向层析免疫分析**
纳米抗体基侧向层析分析已扩展至多个领域：兽医诊断中检测活动性锥虫感染；病毒检测中用于尿液样本中的寨卡病毒NS1检测；SARS-CoV-2核衣壳检测的全纳米抗体视觉侧向层析分析；以及食品安全监测中用于杏仁奶中黄曲霉毒素B1检测的GFP融合纳米抗体探针、纳米抗体-量子点定向侧向层析分析以及基于纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白的生物发光侧向层析免疫分析。
**5.1.5 表面增强拉曼散射免疫分析**
纳米抗体特别适合SERS免疫分析，因其小尺寸、高稳定性和模块化可工程化特性便于与等离子体探针和纳米颗粒基信号标签整合。纳米抗体相容的SERS免疫分析已报道用于血浆中多重白细胞介素检测和霉菌毒素分析，以及在低浓度下检测SARS-CoV-2抗原时显示出 improved sensitivity。
**5.1.6 电化学和光学生物传感器**
纳米抗体与导电纳米材料（金属纳米颗粒、碳材料或纳米纤维膜）结合可改善电极性能，促进电子转移、增加电活性表面积并提高探针负载量。探针取向、固定化化学和分子间距均影响抗原获取和信号产生，因此常用位点定向偶联和间隔臂设计来减少空间位阻。实际应用案例包括：使用光催化-电化学氧化还原循环检测犬弓蛔虫抗原的纳米抗体免疫传感器；花生过敏原Ara h 1的纳米抗体微全电化学免疫分析（灵敏度较传统夹心ELISA提高约11倍）；工程化VHH9在金纳米颗粒负载纳米纤维膜上的定向固定用于对硫磷检测的无标记电化学传感器；以及PEDOT:PSS/金纳米颗粒平台用于可溶性CTLA-4的超灵敏电化学检测。此外，纳米抗体功能化有机电化学晶体管可实现COVID-19和MERS抗原的快速检测，纳米抗体-场效应晶体管界面通过传感表面位点特异性探针取向实现超灵敏癌症生物标志物检测。
**5.2 体内纳米抗体医学成像应用**
纳米抗体正越来越多地被探索作为非侵入性分子成像探针，特别是在癌症、炎症性疾病和特定免疫相关疾病的临床前研究中。其小尺寸、快速组织渗透和位点特异性标记兼容性支持其用于PET、SPECT和光学成像的开发，部分示踪剂已开始向临床转化推进。
在核医学成像中，纳米抗体可用短半衰期放射性核素如
68Ga、
99mTc和
18F标记，近期位点特异性标记策略（包括sortase介导的
18F偶联）已提高放射化学纯度、可重复性和示踪剂稳定性。纳米抗体还可与放射性金属螯合剂偶联用于PET和SPECT，或与近红外荧光团如IRDye800CW偶联用于光学和荧光引导成像。
抗HER2纳米抗体PET成像可在示踪剂给药后60–90分钟内实现HER2表达病灶的高对比度可视化，这主要得益于快速血液清除和高靶点特异性。后续I期和II期临床研究表明，[
68Ga]Ga-NOTA-anti-HER2 sdAb PET/CT可在早期成像时间点检测原发和转移性病灶，具有低血池活性、可重复的肿瘤摄取以及揭示病灶间HER2表达异质性的潜力。抗CEA纳米抗体探针同样显示出结直肠肿瘤荧光引导可视化和术中边界改善的前景。纳米抗体-量子点偶联物进一步通过利用量子点的亮度和光稳定性实现对微转移和播散肿瘤细胞的灵敏检测。
## 6 纳米抗体诊断应用的临床转化
纳米抗体已从实验性结合试剂进展到临床验证的治疗药物，其诊断应用也正向临床转化推进，特别是在分子成像和分析开发方面。
**6.1 纳米抗体诊断应用的临床成功与在研临床试验**
COVID-19大流行期间，纳米抗体成为多功能诊断和抗病毒试剂。纳米抗体Nb-H6通过阻断刺突-ACE2相互作用对多种SARS-CoV-2变体表现出广谱中和活性。纳米抗体的高稳定性可实现雾化吸入递送，纳米抗体基快速抗原检测已在亚纳摩尔浓度下实现病毒蛋白的灵敏检测。
在成像方面，使用
68Ga标记抗PD-L1纳米抗体的首次人体PET/CT研究报道了良好的生物分布、快速清除和高肿瘤对比度，支持进一步临床评估。纳米抗体LFAs已用于寄生虫感染如锥虫病的检测，纳米抗体免疫分析也已用于食源性病原体检测。
**6.2 纳米抗体治疗应用的临床成功与在研临床试验**
纳米抗体治疗药物已获得监管批准，包括caplacizumab（Cablivi）——一种靶向血管性血友病因子（vWF）A1结构域的人源化二价纳米抗体，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）。TITAN和HERCULES研究显示，与安慰剂相比，caplacizumab可更快地使血小板计数正常化，减少血栓事件、疾病复发和TTP相关死亡率。
Ozoralizumab（Nanozora）是一种三价抗TNF-α纳米抗体构建体，已在日本获批用于治疗类风湿关节炎。Envafolimab是一种皮下给药的抗PD-L1单域抗体与人Fc融合蛋白，已获批用于治疗特定实体瘤。
细胞治疗方面，ciltacabtagene autoleucel（Carvykti）是一种含两个BCMA结合单域抗体的BCMA靶向CAR-T细胞疗法，在复发或难治性多发性骨髓瘤中显示出显著疗效。Sonelokimab是一种靶向IL-17A和IL-17F的三价纳米抗体，在炎性疾病中显示出良好活性，目前正在进行后期临床试验。
自身免疫和免疫介导炎症性疾病（包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、炎症性肠病和1型糖尿病）的纳米抗体治疗也在积极研究中。
## 7 展望与结论
自1993年发现骆驼科天然重链抗体以来，纳米抗体技术已发展为分析开发、生物传感和分子成像的多功能平台。其小尺寸、高溶解度、稳定性和高亲和力特异性抗原识别能力，在需要紧凑探针设计、模块化重构或位点定向标记的特定诊断环境中优于传统单克隆抗体。
**7.1 支持纳米抗体临床转化的诊断优势**
纳米抗体的结构和工程多功能性促进其整合到ELISA、电化学发光和荧光分析、侧向层析免疫分析、SERS分析和电化学/光学生物传感器等多种诊断平台中。其延长的CDR3区域和识别隐蔽或凹陷表位的能力可扩大靶向性，在表位可及性受限的环境中提供分析优势。纳米抗体工程、高通量文库筛选和可扩展表达系统的进展进一步扩展了可用库，包括多价、多特异性和融合格式，从而增加了功能灵活性并在匹配分析设计时增强灵敏度、特异性和整体分析性能。
**7.2 纳米抗体诊断转化的挑战与未来前景**
**7.2.1 药代动力学优化以降低肾脏背景**
纳米抗体面临的近期待转化重点是缓解快速清除和肾脏背景，同时保持使其成为有吸引力的诊断和成像试剂快速靶点访问特性。应用依赖性的半衰期延长策略——如Fc融合、白蛋白结合模块或聚合物偶联——可增加流体力学尺寸并延长全身暴露，从而在需要较长循环时改善靶点累积。同时，减少肾脏滞留和背景信号对于体内成像至关重要，可通过优化探针电荷和亲水性、选择具有有利代谢特征的标记化学以及调整剂量和成像时间窗口来实现。
**7.2.2 AI指导的多目标纳米抗体设计用于可开发性和转化**
人工智能正为纳米抗体发现和工程提供有价值的补充工具，特别是在候选物优先排序、序列排序、人源化支持和可开发性评估方面。NanoBinder等机器学习模型可根据预测的结合相关兼容性、天然性等可开发性相关特征进行过滤；AbNatiV提供残基级天然性评分支持合理的纳米抗体人源化；生成式AI已开始直接贡献于纳米抗体文库设计和候选物生成，如用于构建小型但高效文库的自回归生成模型，以及用于设计Omicron-RBD靶向纳米抗体的深度生成建模和表位景观分析。
**7.2.3 平台协同优化的多价和多特异性纳米抗体构建体**
多价和多特异性纳米抗体构建体为解决诊断中灵敏度不足和异质性样本中特异性降低的两个持续瓶颈提供了合理途径。然而，这些增益强烈依赖于几何构型和环境，使得连接子长度、刚性和结构域取向成为关键设计变量。构建体工程应与平台感知优化协同进行，因为不同模式的主要约束不同：在基于流动的格式如LFAs中，性能由对流流动下的质量运输和结合动力学决定；在表面固定生物传感器和电化学发光分析中，取向控制、表面密度和标记化学计量通常决定背景和动态范围。
**7.2.4 纳米抗体诊断近期临床转化的优先疾病领域**
临床上，纳米抗体诊断最清晰的近期机会在于传染病和肿瘤学领域。在传染病方面，快速结合物生成、试剂稳健性和与简单分析格式的兼容性非常适合疫情响应和中心实验室之外的检测。在肿瘤学方面，首个
68Ga-HER2纳米抗体PET/CT人体研究显示安全给药和清晰病灶可视化，PD-L1纳米抗体PET工作可捕捉活检评估可能遗漏的空间异质性。自身免疫和炎症性疾病是实际的下一步，而神经系统疾病仍是更高门槛但潜在高影响的前沿领域，主要障碍是递送和信号保真度而非相关靶标的缺乏。
