《Journal of Neuro-Oncology》：CSF ctDNA analysis guides molecular reclassification of diffuse glioma patients
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摘要
背景：胶质瘤患者的诊断与监测亟需更优策略。液体活检较组织活检侵袭性更低，且适于在多个时间点进行连续采集。然而，由于技术性挑战，来源于胶质瘤患者脑脊液（CSF）的循环肿瘤DNA（ctDNA）分析在临床实践中仍未得到充分应用。
方法：研究人员收集了43例
摘要
背景：胶质瘤患者的诊断与监测亟需更优策略。液体活检较组织活检侵袭性更低，且适于在多个时间点进行连续采集。然而，由于技术性挑战，来源于胶质瘤患者脑脊液（CSF）的循环肿瘤DNA（ctDNA）分析在临床实践中仍未得到充分应用。
方法：研究人员收集了43例不同类型胶质瘤患者的脑脊液样本，并采用覆盖600个肿瘤相关基因的下一代测序（NGS）panel对来源于脑脊液的ctDNA进行评估。
结果：从脑脊液（0.4–5 mL）中获得的总无细胞DNA（cfDNA）浓度范围为0.09–60 ng/μL。43份样本中有26份（60%）检测到突变，其中19/43（44%）存在单核苷酸变异（SNV），11/43（25%）存在拷贝数变异（CNV），8/43（18.6%）存在移码突变，1/43存在融合（2.3%）。17份脑脊液样本未检出突变，其中大多数样本（15/17；88%）DNA输入量不足（< 30 ng）。研究人员在脑脊液中鉴定出具有诊断意义的改变，包括IDH1突变（6例IDH突变型胶质瘤中的3例）、TERTp突变（29例胶质母细胞瘤中的7例）、EGFR扩增（29例胶质母细胞瘤中的5例）以及H3-3 A突变（4/4例儿童高级别胶质瘤）。其中部分突变结合其他临床参数，可依据2021年世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类识别特定中枢神经系统（CNS）肿瘤类型，从而使3例患者的诊断得到重新分类。此外，研究人员观察到脑脊液ctDNA检出与影像学特征之间存在显著相关性。
结论：本研究强调了脑脊液ctDNA分析在胶质瘤患者评估与重新分类中的潜在临床应用价值。
本文发表于《Journal of Neuro-Oncology》，聚焦于脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）在弥漫性胶质瘤分子诊断中的临床应用价值。研究背景在于，中枢神经系统（CNS）肿瘤总体死亡率高，而胶质瘤的诊断、分级与治疗决策高度依赖病理组织学与分子分型。尽管增强磁共振成像（MRI）是胶质瘤诊断的标准影像学工具，但单纯依赖影像学难以对肿瘤实体作出确定性判断。组织活检虽然仍是金标准，但其存在明显局限：取材具有侵袭性，深部或关键功能区病灶可能难以安全活检；肿瘤内异质性可能导致局部取样偏倚；单次组织取样亦无法动态反映残余病灶及肿瘤演化。基于此，开发一种创伤更小、可重复采样、能够同时反映分子特征与疾病进展状态的液体活检策略，具有明确临床需求。相较血浆，脑脊液（CSF）更贴近CNS肿瘤病灶，受血脑屏障（BBB）影响较小，因此更适合作为脑肿瘤ctDNA检测的液体样本来源。尽管既往已有研究提示CSF ctDNA可用于检测关键基因改变，但在胶质瘤中的临床转化仍受技术难点和证据不足限制，因此研究人员开展了本研究。
研究人员纳入2018—2023年间43例胶质瘤患者的CSF样本，涵盖胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）、IDH突变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、弥漫中线胶质瘤H3K27-altered、弥漫性半球胶质瘤H3 G34-mutant及弥漫性胶质瘤未特指型（NOS）等类型，系统评估CSF来源ctDNA的可检测性、突变谱及其对肿瘤重新分类的辅助意义。研究结果表明，采用大规模靶向下一代测序（NGS）可在多数样本中识别具有诊断意义的分子改变，尤其可辅助识别IDH1、TERTp、EGFR与H3-3 A等关键事件；更重要的是，研究人员据此完成了3例患者的分子引导重新分类，提示CSF ctDNA可弥补初始组织分子信息缺失或不完整的不足。研究还发现，ctDNA检出与肿瘤体积、肿瘤直径及脑膜转移性播散（LMD）状态存在关联，支持其作为疾病评估工具的潜力。总体而言，论文证明了CSF ctDNA在胶质瘤分子分型、辅助诊断与临床再分层中的现实应用前景。
主要技术方法概括：本研究为回顾性研究，纳入43例胶质瘤患者单次CSF样本，样本来源包括腰椎穿刺和脑室采集。研究人员提取CSF中的无细胞总核酸（cfTNA），采用自建600基因肿瘤相关NGS panel、双链测序策略及误差校正生物信息学流程，检测单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（indel）、移码、融合和拷贝数变异（CNV）。同时结合标准化脑MRI进行肿瘤体积、肿瘤直径、Evans指数及LMD分级评估，并在部分病例中与配对肿瘤组织测序结果进行一致性分析。
一、Patient characteristics
研究共纳入43例已确诊胶质瘤患者，男性31例、女性12例，年龄18–84岁，以4级肿瘤为主。病例类型以GBM, IDH-wildtype最多，其余包括IDH突变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、弥漫中线胶质瘤H3K27-altered、弥漫性半球胶质瘤H3 G34-mutant和NOS类型。15例为LMD阳性，24例为LMD阴性。该队列为后续评估CSF ctDNA检测效能及临床相关性提供了基础。
二、NGS quality metrics
研究所用检测体系的最佳cfDNA输入量为30 ng，但由于CSF中cfDNA总量有限，实际输入量范围为0.5–30 ng，平均12.3 ng。研究显示，cfDNA输入量越高，平均靶向捕获率与平均测序深度越高；cfDNA输入量与on-target rate及mean target coverage均呈显著相关。这说明样本DNA质量和输入量是影响CSF ctDNA检出率的重要技术因素，也解释了部分阴性样本的产生原因。
三、Reported genomic alterations from CSF
43份样本中26份检出基因改变，总检出率为60%。其中包括SNV 19例、indel/移码8例、CNV 11例及融合1例。未检出突变的17份样本中，88%存在DNA输入不足。最常见改变涉及TERT启动子、EGFR、TP53、IDH1、NF1、H3-3 A、MTOR、PDGFRA、ARID1A、PIK3CA、DNMT3A、HGF、SETD2、BCOR、STAG2，以及EGFR、CDKN2A、CDKN2B、PTEN的CNV。该结果表明，CSF ctDNA可覆盖胶质瘤中多种具有诊断和生物学意义的变异类型。
四、Molecular guided tumor re-classification
这是本研究最具临床意义的部分。研究人员在3例患者中通过CSF ctDNA发现关键诊断分子事件，从而结合临床和影像资料，依据2021版WHO CNS肿瘤分类完成重新分类。病例#33的CSF检出H3-3 A p.Lys28Met，对应H3K27M改变；病例#38检出H3-3 A p.Gly35Arg，对应H3 G34R改变；病例#43检出IDH1 p.R132C。上述结果修正了原先依据有限组织病理作出的分类，说明当组织分子检测不充分时，CSF ctDNA可提供决定性补充信息。
五、Evaluation of MRI features and variant allele frequency among patients with different tumor types
研究比较了不同分子亚型中MRI特征与变异等位基因频率（VAF）的关系。在H3K27M/H3 G34R突变胶质瘤中，H3-3 A突变在4/4病例中均被检出，显示100%检出敏感性；肿瘤体积及肿瘤直径与VAF呈较强相关趋势。在IDH突变型胶质瘤中，6例中3例检出IDH1突变，肿瘤体积和肿瘤直径与IDH1突变VAF亦表现出较强相关趋势。相比之下，GBM中TERT突变的VAF与肿瘤体积或直径仅呈弱相关。该结果提示，不同分子类型胶质瘤中，ctDNA释放模式可能存在差异。
六、Evaluation MRI features and CSF-ctDNA mutation status
进一步比较ctDNA阳性与阴性患者的影像学参数后发现，ctDNA阳性组的肿瘤体积和肿瘤最大径均显著高于阴性组，而Evans指数无显著差异。这表明，较大的肿瘤负荷更有利于CSF中ctDNA的释放和检出，也为解释液体活检阳性率的异质性提供了影像学依据。
七、Pretreatment vs. post-treatment analysis
研究比较了治疗前与治疗后采集CSF样本的cfDNA输入量及突变检出情况，结果显示两组之间均无统计学差异。这提示在本队列中，样本采集时点相对于治疗状态并未显著影响ctDNA总体检出情况。
八、Leptomeningeal disease (LMD) and CSF-ctDNA
研究发现LMD状态与CSF ctDNA检出显著相关。LMD阳性患者中13/15（86.7%）检出ctDNA，而LMD阴性患者中为12/24（50%），差异具有统计学意义。这说明肿瘤沿脑膜或蛛网膜下腔播散时，更可能向CSF释放可检测DNA片段，CSF ctDNA因此可能成为LMD早期识别和病情监测的重要分子工具。
九、Comparison of genomic alterations from CSF NGS with matched tumor tissue
在21例具有配对肿瘤组织测序数据的患者中，研究人员比较了CSF与组织间的一致性。若仅考虑SNV、移码、indel和融合，CSF中44.26%的改变与组织匹配；若将CNV纳入，总体一致率为30.48%。在cfDNA输入量达到30 ng的亚组中，一致率明显提高：序列水平改变一致率为75%，纳入CNV后为59%。该结果说明，CSF ctDNA总体能够部分反映肿瘤组织基因组图谱，而较高质量样本可显著提升一致性。
十、Survival outcome associated with CSF ctDNA mutation status in the GBM subgroup
在GBM亚组中，研究人员分析了CSF ctDNA阳性与阴性状态的预后意义。Kaplan–Meier分析显示，两组总体生存期差异无统计学意义。ctDNA阳性组中位生存期为623天，阴性组为685天，提示在本研究样本量下，单纯以ctDNA是否检出作为GBM预后指标证据不足。
讨论部分指出，本研究的核心价值在于证明了大靶向基因panel的CSF ctDNA测序可同时检测SNV、CNV、indel及融合，从而较单一位点方法更适合复杂的CNS肿瘤分子诊断场景。研究人员强调，WHO CNS肿瘤分类涉及140余种实体及大量具有诊断意义的遗传改变，NGS在广谱检测、肿瘤抑制基因异常识别和临床实验室流程整合方面具有明显优势。研究同时指出，约58%的ctDNA阳性病例具有可支持WHO CNS5诊断的分子证据，结合影像和临床特征可显著提升分类准确性。对于LMD，CSF ctDNA的高检出率进一步说明其在播散性病变评估中的独特价值。论文也诚实指出局限性，包括样本量较小、部分相关性未达统计学显著、仅49%病例具有配对组织数据，以及部分低输入样本缺乏独立正交验证，因此结果仍需更大规模研究确认。
研究结论部分可译为：综上，研究结果有力证明了脑脊液（CSF）作为中枢神经系统（CNS）肿瘤患者微创诊断工具的应用价值。相关结果促成了3例初始缺乏分子特征分型患者的分子引导性肿瘤重新分类。此外，本队列中脑脊液ctDNA突变存在与脑膜转移性播散（LMD）状态之间的显著相关性，这可能有助于疾病早期诊断和治疗反应评估。这些结果强调了CSF分析在提供关键分子信息、提高诊断准确性以及指导CNS肿瘤患者靶向治疗策略方面的潜力。尽管已有多项研究证实来源于CSF的ctDNA可进行突变检测，但将ctDNA水平与胶质瘤影像学特征（如肿瘤体积、肿瘤直径、Evans指数及LMD状态）相关联的研究仍较少；同时，在ctDNA含量有限样本中探讨NGS质量指标与突变检出关系的研究亦较为有限。
