用于尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）活性的“关闭型”光声对比剂

《npj Biomedical Innovations》：A “turn-off” photoacoustic contrast for urokinase-type plasminogen activator activity

　　

利用非侵入性分子成像技术根据侵袭性区分癌变病灶的能力使得诊断和分型更加精确准确。在结直肠癌（CRC）筛查中，目前广泛使用血液或粪便检测以及内窥镜检查等方法。然而，可靠地区分恶性腺瘤样病变与良性病变，特别是那些直径≤5 mm的病变，仍然是一个重大的临床挑战。研究人员合成、优化并验证了一种小分子近红外（NIR）激活型光声染料，该染料偶联了针对尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA，一种在结直肠癌组织中上调的蛋白酶）特异的三肽底物。该探针被设计为在uPA激活后产生“开-关”（ON-OFF）光声信号。研究人员使用两种具有不同uPA和组织蛋白酶B（cathepsin B）表达水平的结直肠癌细胞系评估了探针针对侵袭性的特异性。该uPA响应型光声探针显示出高灵敏度，并针对uPA活性表现出清晰的“开-关”激活信号。它在具有不同uPA表达水平的结直肠癌细胞系之间显示出强特异性，证实了它的选择性激活。利用光声成像非侵入性地监测细胞外uPA活性，显示出作为区分恶性和癌前结直肠病变（特别是那些较小且难以使用当前筛查方法分类的病变）的预测性筛查方法的希望。

研究背景：结直肠癌（CRC）是全球最致命的癌症之一，也是男女第三大常见癌症，每年报告约90万例死亡。组织学证据表明结肠癌是一种缓慢演进的癌症，通过腺瘤-癌序列从腺瘤性息肉发展而来。虽然通过结肠镜息肉切除术有效去除腺瘤性息肉与CRC发病率的降低相关，但即便使用目前的金标准结肠镜检查技术，仍有相当一部分息肉（约21%）在筛查中被遗漏，尤其是平坦息肉和小于5 mm的腺瘤。此外，息肉被表征为腺瘤性、错构瘤性、炎性、良性或恶性，由于缺乏每种息肉完整的分子表征，对于是否需要全部切除尚无明确共识。因此，通过分子标记物改进结肠息肉检测具有重要影响，因为这些标记物可以超越单纯的解剖差异来评估恶性程度。此前，多种蛋白水解酶被涉及胃肠道组织重塑和血管生成过程。尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）及其细胞表面受体（uPAR）在纤溶酶原-纤溶酶系统中起重要作用。在乳腺癌和结直肠癌（CRC）中，该系统与不良预后密切相关，uPA高水平与肿瘤细胞迁移增强和复发风险增加相关。在近期CRC患者的基因组分析中，预后驱动基因主要代表EGFR、KRAS、BRAF或TGFβ通路，uPA与TGFβ通路有重要的相互作作用和正反馈环路，突变的KRAS通过AP-1转录因子诱导uPAR表达。在涉及CRC患者的临床研究中，uPA的检测被报道是比常用肿瘤标记物如胃肠道CA-19-9更重要的预后标记物，高uPA水平与肿瘤出芽相关，而肿瘤出芽与远处转移密切相关。CRC患者血清和血浆中uPA水平通常使用酶联免疫吸附测定（ELISA）、mRNA定量或免疫组织化学染色测量，但这些方法受限于繁重的样品制备和不同提取方案引入的变异性，更重要的是，它们报告的是uPA或其受体uPAR的表达水平，不一定反映活性酶的量，因为表达可能包括活性uPA及其无活性酶原形式。相比之下，uPA响应成像探针将仅在细胞外环境中存在活性酶时产生可测量的信号。尽管有此优势，目前很少有能有效非侵入性检测体内活性uPA的小分子成像探针。临床分子成像模态如PET、MRI和荧光成像各有固有局限：MRI灵敏度低，需要毫摩尔浓度的对比剂；PET空间分辨率有限且涉及放射性和高成本；荧光成像受浅组织穿透和自体荧光的限制。这些局限性凸显了对更新的、临床可转化的混合成像策略的需求。光声（PA）成像是一种相对较新的技术，提供高空间和时间分辨率且无电离辐射，实现比光学成像更深的组织穿透（约5 cm），并提供类似超声的空间分辨率，这些属性支持其强大的临床采用潜力，包括PA断层扫描和光声内窥镜。小分子靶向对比剂因其高特异性和比纳米颗粒基试剂更快的清除率而在分子诊断中特别有利。此类探针可以通过选择可调染料骨架并将它通过连接子直接连接到靶向部分（如肽或抗体）来构想，从而选择性响应感兴趣的生物学标志物。最近，已报道了两种用于检测浸润性乳腺癌模型中uPA活性的光声探针：一种是产生双重荧光和PA信号的可激活聚合物报告探针，另一种是具有自组装基序的小分子PA探针。所有这些设计，包括本研究的设计，都利用了uPA特异的GGR三肽。然而，与先前探针中N端甘氨酸用Cbz（羧基苯甲酰）基团保护不同，本研究探针采用去保护的三肽，从而改善了水溶性和较小分子量（约低400 Da）的小分子行为特征。关键区别在于响应机制：本研究探针在uPA激活后产生光声信号减少（“关闭型”，turn-off），而早期探针主要作为“开启型”（turn-on）NIR-PA或仅PA的试剂。在这项工作中，研究人员提出了这种小分子、uPA响应、“关闭型”PA探针，并通过非侵入性PA成像评估了uPA响应性和机制以供未来转化。

主要关键技术方法：研究人员合成了一种名为GGR-IR780的小分子光声探针，该探针由近红外（NIR）染料IR780-碘化物通过对氨基苯酚连接子偶联至uPA特异性三肽底物Gly-Gly-Arg（GGR）构成，合成路线共7步并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和高性能液相色谱（HPLC）进行表征。研究人员通过紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和多光谱光声断层扫描（MSOT）系统评估了探针的光物理和光声特性及其稳定性。为验证uPA响应性，研究人员在溶液中用uPA酶孵育探针，并利用光声成像、荧光光谱、HPLC和基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱及一维质子NMR监测信号损失和产物形成，同时用uPA抑制剂（阿米洛利盐酸盐）和其他蛋白酶（cathepsin B、MMP-2）测试特异性。研究人员通过在不同底物浓度下用PA成像监测初始反应速率，进行了基于光声的米氏-门滕（Michaelis-Menten）酶动力学分析。此外，研究人员使用两种人类结直肠腺癌细胞系（HCT-116和Caco-2，具有不同uPA表达和侵袭能力）的裂解物，通过Western blot、比色uPA assay、细胞毒性（SRB）assay和纵向光声成像评估了探针区分侵袭性与非侵袭性癌细胞的能力，并使用嵌套仿体模型验证了检测小至2.5 mm病灶的能力。

研究结果：

A small molecule tripeptide conjugated, water soluble, uPA-activatable PA probe（一种小分子三肽偶联、水溶性、uPA可激活的PA探针）：研究人员设计了小分子uPA响应性光声探针GGR-IR780，用于在IR780-碘化物NIR染料骨架上通过在对氨基苯酚连接子上的三肽Gly-Gly-Arg（GGR）共轭以有效、敏感和特异地检测细胞外uPA活性。该探针经7步开发，产物通过^{1H和13C NMR光谱和质谱表征，最终化合物经HPLC纯化（C-18柱，R_t=12.2 min）并通过MALDI质谱和2D TOCSY NMR验证。探针在水中可溶，确立了良好的生物相容性。UV-Visible吸收光谱显示在NIR范围有尖锐吸收带，DMSO中λ_max为783 nm，水中为766 nm；摩尔消光系数两者相似（?_DMSO＝135,748 M?1cm?1，?_water＝92,481 M?1cm?1），表明在水介质中最小H-聚集或更高阶聚集。荧光发射研究显示λ_ex＝700 nm时最大荧光强度在λ_em＝812 nm，斯托克斯位移Δλ为30 nm。光声特性在TRIS（pH 7.4）中低至50 μM浓度下显示优异PA灵敏度，且在高达200 μM浓度范围内PA强度随浓度线性增加。NIR-I窗口（700–900 nm）组织自体荧光极小，探针的700/812 nm激发/发射剖面位于此低背景范围内，规避了显著的转化挑战；内源性发色团如血红蛋白和氧合血红蛋白表现光声吸收，但其消光系数（~103M?1cm?1）远低于GGR-IR780探针（92,481 M?1cm?1），导致最小干扰，此外跨多达三个波长的多光谱分离（MSOT）可通过算法分离Hb/HbO₂贡献，确保准确的探针特异性光声信号检测。关于花青荧光团在高浓度下易光漂白的敏感性，研究人员在pH 7.4下通过吸收研究调查了探针溶液稳定性并与游离IR780-碘化物比较；尽管游离IR-780碘化物表现出有限光稳定性（4小时内吸收随时间依赖性减少），GGR-IR-780在相同条件下表现出显著增强的稳定性。同样，使用动态光声成像，研究人员在1小时内每10分钟间隔及随后至4小时每30分钟间隔研究了250 μM探针溶液在DMSO中的稳定性，观察到优异稳定性，即便如此高浓度下最大PA强度也无显著变化。为验证检测非常小病变（≤5 mm）的uPA响应探针灵敏度，研究人员使用嵌套仿体设计进行光声成像；通常的组织模拟琼脂-脂肪乳模具包含一个内径（ID）6 mm的主要圆柱插入件，其中放置内径2.5 mm的次级毛细管插入件。对照条件两个插入件充满水时期望在任一区域观察到最小光声信号；相反当外部6 mm插入件充满水且内部2.5 mm毛细管充满GGR-IR780探针溶液时，仅从2.5 mm毛细管插入件检测到明显且局部化的光声信号，毛细管插入件的信号强度大幅高于背景并表现出GGR-IR780探针特征PA光谱轮廓。这些结果证实uPA响应探针能够清晰且空间局限地检测直径小至2.5 mm的目标，支持使用成像策略识别亚5 mm病变的可行性。}

Loss of photoacoustic signal upon response to urokinase-type plasminogen activator (uPA) activity（响应尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）活性时光声信号丧失）：为研究GGR-IR780对uPA活性的响应性，研究人员监测了NIR荧光和PA信号变化，GGR-IR780溶液（TRIS缓冲液）在37 °C与10酶单位（EU）孵育，两种情况下均观察到突出信号损失，表明响应酶活动后为荧光或PA“关闭型”。有趣的是，4小时时光声信号损失为57%，而荧光信号在相同酶单位24小时孵育后才演示54%信号损失，表明所开发探针的PA比NIR荧光对检测uPA响应具有更高灵敏度和时间分辨率。为定量评估uPA响应光声探针的灵敏度，研究人员评估GGR-IR780响应，即归一化光声信号（PA/PA₀）相对于酶浓度的斜率，并将其与市售比色uPA底物（ECM600, Sigma-Aldrich）的归一化吸收响应（A/A₀）比较，其中PA₀是无酶时基线信号，A₀是无酶时同比色探针吸收。GGR-IR780的PA/PA₀校准曲线斜率为?0.0092 U/μL，表明对uPA介导激活的高灵敏度；负斜率指示PA信号减少，不同于其他探针中酶激活后信号常规增加。在2.5–20 EU范围内观察到PA信号强度与酶浓度线性相关性，检测限（LOD）计算为20.96 U/μL。这些结果证明了GGR-IR780的定量灵敏度，并突出其与标准比色测定相当的性能。为评估探针对uPA活性的特异性并验证“关闭型”属性或PA信号损失确实由于酶活动，研究人员获取了GGR-IR780仿体（TRIS缓冲液，100 μM）与uPA酶（10 EU）和uPA抑制剂（10 mM，amiloride hydrochloride）鸡尾酒在37 °C 4小时内的纵向光声光谱；几乎完全PA信号保留伴随uPA抑制剂，因此证实响应uPA观察到的信号损失确实由于高uPA酶活性。此外，研究人员用也曾在结直肠癌中上调的cathepsin B和MMP-2酶测试探针；尽管与MMP-2孵育未观察PA信号减少，但与cathepsin B孵育观察到了显著的PA信号减少，虽然uPA活性引起的PA信号减少相当更高。因此GGR-IR780探针对uPA具有中等高但并非完全特异性。这些与uPA酶和uPA抑制剂以及其他在侵袭性结直肠癌中过表达的蛋白酶孵育后的光声成像结果暗示研究人员开发了作为“关闭型”探针功能的探针，其中信号损失可预测作为生物标志物的高酶活性。

研究人员随后通过HPLC（C-18柱）跟随酶反应（10 EU）在GGR-IR780上 mechanistic研究酶孵育后PA信号损失。观察到对应GGR-IR780的亲峰（R_t＝12.2 min）约45%减少，并在孵育1小时后出现明显新峰（R_t＝10.5 min）。即便更长孵育期（5小时）相同酶单位和探针浓度未观察亲峰完全消失。收集R_t＝10.5 min新峰组分运行PA光谱，未演示任何PA活性，确证了较早结果。这也似乎暗示一旦肽被切割，仅与酚连接子连接的染料不稳定，因此导致PA活性丧失。比较GGR-IR780与新产品（R_t= 10.5 min）的MALDI质谱，观察到对应[M]⁺的分子离子峰m/z 882.52在产品中完全缺席；酶切割肽GGR后，预期染料现在仅与带游离胺（-NH₂）的连接子连接，注释为“M”。在产品峰的MALDI质谱中，观察到铵（m/z＝631.1）和ACN（m/z＝653.1）加合物质谱峰，从而确认预期肽切割，然而也确认更高质量m/z＝1013.36的新峰，暗示可能的无酚连接子的染料片段二聚化。这种可能的二聚化可以解释酶响应后PA信号丧失。为进一步量化探针如何响应酶活性改变结构，研究人员执行时间变量1D NMR光谱（600 MHz, Bruker）。先前已在CD₃OH氘代溶剂中通过^{1H NMR表征GGR-IR780中质子，选择此氘代溶剂以最大化观察更快交换的N-H质子机会。在此实验中，研究人员在含约10% D₂O的H₂O中制备1 mM GGR-IR780溶液，因为酶反应通常需要水环境。获取初始水压制1D NMR光谱后，向溶液添加10 EU酶并每30分钟记录1D NMR光谱，然后从6至12小时每小时记录。两个光谱中δ 4.65的倒质子峰是1D NMR中氘代溶剂的水压制峰。尽管N-H质子信号难以观察，烯烃-芳香区（δ 6.0–9.83 ppm）出现显著光谱变化，表明肽键切割和染料结构改变；δ 6.0 ppm宽单峰向下场移动0.6 ppm（至δ 6.6 ppm），δ 7.0至7.7 ppm多重簇积分至7个质子而非12个，与芳香和烯烃环系统部分分解一致。三个最向下场位移质子（δ 9.8, 8.4, 和8.3 ppm）在两个光谱中保持不变，暗示含这些质子的吲哚环在酶活动期间保持完整，这些向下场位移质子应属于带有正电荷的吲哚环。在脂肪族区，观察到肽相关峰变化和质子积分差异，支持溶液中两种不同物种的存在，这些观察与先前MALDI和PA光谱数据一致，显示GGR-IR780酶处理期间反应产物形成。}

PA imaging derived enzyme kinetics measurements demonstrate high binding affinity but moderate catalytic efficiency of the GGR-IR780 probe（光声成像衍生的酶动力学测量证明GGR-IR780探针具有高结合亲和力但中等催化效率）：研究人员随后验证uPA对GGR-IR780的酶动力学剖面，使用光声成像而非文献中基于吸收和荧光的动力学研究。GGR-IR780探针浓度范围35至100 μM（TRIS缓冲液，pH 7.4）与10酶单位（EU）孵育，收集共4小时动态光声光谱。每个浓度从获取前35分钟计算初始速度。记录每个浓度在764 nm的初始PA强度，以及每个浓度PA强度随时间减少，获得的初始速度与首次使用PA的酶活动确定动力学和效率。动力学的线性Hanes–Woolf拟合显示V_max为1.03 ± 0.4 μM/min，米氏常数K_m为（47.54 ± 6.87）× 10⁶M用于基于PA信号酶活动测量。米氏-门滕常数K_m（结合亲和力测量）计算为47.54 ± 6.87 μM，表明探针对uPA非常高亲和力，与其他酶响应CEST MRI试剂和最近开发的聚合uPA响应NIR/PA探针比较。此外，研究人员比较转换数或催化速率常数（k_cat），即1秒内酶在底物上作用效率的测量；观察到k_cat值为0.011954 s^?1，约比早前报告的聚合uPA响应NIR/PA探针低400倍，但与在临床前模型中开发和研究的其它酶响应探针相当。探针催化效率（k_cat/K_m）计算约为2.7×10²M^?1s^?1，暗示尽管酶与底物结合更高，作用效率较低。理想地，Michaelis-Menten酶动力学产生最准确结果时底物浓度范围在K_m值3至5倍之间；然而与其他类似研究一样，受限于高于100 μM浓度时探针浓度与光声信号强度之间线性关系的破坏，研究人员浓度范围受限。

PA imaging in colorectal cancer cell lines with GGR-IR780 can distinguish between aggressive vs. non-aggressive cancer cells（用GGR-IR780对结直肠癌细胞系进行PA成像可以区分侵袭性与非侵袭性癌细胞）：为此研究，研究人员选择两种人类结直肠腺癌细胞系，HCT-116和Caco-2，尽管源自结直肠肿瘤，但表现显著不同生物学行为。Caco-2细胞报告抵抗雷帕霉素，而HCT-116细胞雷帕霉素敏感；此外，HCT-116细胞比Caco-2细胞表现出显著更高致瘤和侵袭能力。因此Caco-2细胞代表具有低转移潜力的结直肠癌模型，而HCT-116细胞被认为更具侵袭性且高度转移。这种区别反映在伤口愈合试验报告中，Caco-2细胞显示有限迁移且即便72小时后也无法闭合伤口，而HCT-116细胞演示快速伤口闭合，表明增强运动性。这些表型差异延伸至尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）系统。Caco-2细胞表达非常低水平uPA受体（uPAR），通常每个细胞少于1000拷贝，因此经常用作低uPAR表达对照模型；相反，HCT-116细胞显示与显著更高uPA在转录和蛋白水平表达相关的增强侵袭行为。为确定这些差异是否延伸至uPA表达，研究人员首先进行细胞裂解物蛋白提取物的Western blot分析，发现HCT-116细胞产生比Caco-2细胞显著更高水平uPA。随后研究人员用两细胞系裂解物进行比色uPA assay以评估两细胞系间uPA活性差异；此市售比色试剂盒提供来自人尿的uPA冻干粉作为阳性对照，观察两细胞系20分钟内均有活性，虽然HCT-116活性比Caco-2显著更高。这进一步确立uPA活性和表达（如临床数据观察）是结直肠肿瘤侵袭性潜在标记物，并可能也用于预后判断结肠息肉为良性或恶性。为评估生物相容性，研究人员用GGR-IR780在HCT-116细胞中进行细胞毒性研究，使用磺酰罗丹明B（SRB）assay，确立试剂在100 μM以下具有最小毒性。最后，研究人员进行GGR-IR780与两细胞系裂解物孵育的纵向光声成像，以评估检测uPA活性的灵敏度及用光声成像区分侵袭性与非侵袭性结直肠癌细胞的特异性。观察HCT-116细胞3小时后PA强度下降56%，Caco-2细胞仅下降33%，证明侵袭性结直肠肿瘤细胞与非侵袭性细胞相比PA强度下降几乎两倍。有趣的是，研究人员观察在体外设置中最大酶活性在孵育前30分钟内观察，溶液研究中看似低催化效率在计算中不是令人担忧的阻碍。虽然GGR-IR780探针未表现完全uPA活性特异性（如较早特异性实验指示），HCT-116裂解物中观察的56% PA信号减少可能部分反映此细胞系中存在高cathepsin B活性。重要的是，这不削弱探针的整体效用或有效性。先前报告和Western blot分析证明cathepsin B在侵袭性结直肠癌细胞系HCT-116中比非侵袭性Caco-2细胞系显著过表达。因此，即便PA信号减少部分由于cathepsin B活性，也不损害探针的诊断相关性；相反，侵袭性结直肠癌中观察的cathepsin B水平升高进一步支持探针优先在更多侵袭性结直肠肿瘤表型中产生信号的能力。因此，cathepsin B活性的部分贡献不损害，且可能加强探针区分侵袭性结直肠癌的有效性。这些结果证明GGR-IR780探针可被细胞外环境中uPA在短时间内激活，并可区分低和高uPA活性，对应于良性非侵袭性和恶性侵袭性癌症组织。

讨论总结：在酶中，蛋白酶活性在肿瘤生物学中起核心作用，这已通过酶传感器和可激活探针的发展得到验证，这些探针检测酶活性作为恶性程度量度或跟踪治疗的早期反应。在所有非侵入性成像技术中，光学或荧光成像已最大化利用此生物标志物，并开发了众多光学探针，在蛋白酶激活后产生光学或近红外荧光（NIRF）信号。基于相同前提并建立起来的光声成像（一种结合丰富光学对比与声学分辨率且比荧光成像显著更好组织穿透能力（约5 cm）的混合新兴技术）已开发用于检测cathepsins、MMP-2等的PA探针。大多数检测蛋白酶的PA探针是聚合的，因此缺乏小分子对比剂的特异性。本研究中，研究人员开发了水溶性小分子（<1000 Da）PA探针，包含通过短氨基苯酚连接单元偶联至uPA靶向三肽的染料。选择NIR染料IR780以便在远NIR窗口约780 nm吸收，从而实现更大组织穿透。在连接子中，酚部分（-OH）与IR780共轭，氨基部分实现肽偶联。最终探针GGR-IR780保留NIR吸收，但显示比游离IR780-碘化物改善的稳定性。本uPA响应探针行为与大多数其他可激活探针不同的主要点是响应机制，此例中信号被淬灭，导致其作为“关闭型”或淬灭探针功能，而非 usual “开启型”可激活探针。研究人员通过多种实验探讨了此“关闭型”信号的原因。HPLC分析揭示约R_t＝10.5 min出现新峰，表明形成比亲分子略极性的新化合物；uPA介导肽切割后，连接子上游离氨基产生更极性化合物。然而，PA信号完全消失暗示IR染料链降解，导致染料骨架内共轭丧失。尽管缺乏结论性证据，酶孵育探针的质子NMR数据（顶部面板）部分支持芳香环损失和酶活动后多物种存在。值得注意的是，含带末端游离氨基连接子的庚甲川花青染料可能固有不稳定；氮孤对电子可离域进入环系统，触发级联反应破坏庚甲川花青骨架共轭或在连接子切割后促进部分二聚形成，导致观察的m/z 1013峰。极少研究调查了开发的蛋白酶可激活NIRF和PA探针的体外酶动力学参数，因此广泛比较不可行；从酶动力学研究，底物GGR-IR780对uPA显示高结合亲和力，但由于低转换数催化效率似乎仅中等。然而，与一系列其他可