《npj Biosensing》：Detection of α-synuclein aggregates in synucleinopathies: current approaches, biomarkers and challenges
突触核蛋白病是以α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）在脑内聚集为特征的神经退行性疾病，包括帕金森病（Parkinson's disease, PD）、多系统萎缩（multiple system atrophy, MSA）和路易体痴呆（dementia with Lewy bodies, DLB）。在PD和DLB中，αSyn主要在神经元内聚集形成路易体（Lewy bodies）；而在MSA中，αSyn在少突胶质细胞内聚集形成胶质细胞包涵体（glial inclusions）。尽管这些聚集体是病理学标志，但确定性诊断目前仍依赖于死后神经病理学检查。这一局限性促使研究人员大力开发能够在活体患者中检测病理性αSyn的生物标志物。近期进展包括种子扩增技术、脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和外周组织中的生化检测，以及用于体内可视化αSyn病理的影像学方法。这些策略对于改善早期诊断、区分不同突触核蛋白病类型以及监测疾病进展具有重要前景。研究人员在此综述中总结了检测αSyn聚集体的当前方法，包括基于扩增的检测方法、生化检测、组织病理学、影像学技术以及新兴的生物传感器技术，并讨论了其优势、局限性及临床应用前景。
**αSyn聚集体的扩增检测**
种子扩增试验（seed amplification assays, SAA）是敏感性检测聚集态αSyn的重要策略。这些技术利用αSyn聚集体的自传播特性（其功能作为种子），通过体外扩增使病理性蓄积蛋白达到可检测水平。其原理是将疑似含有聚集态αSyn的患者样本与重组αSyn底物混合，经孵育和震摇循环后，病理性种子促进底物转化为纤维状聚集体，后者可通过与荧光染料结合而被检测。目前已发展出多种用于突触核蛋白病诊断的SAA策略：实时震摇诱导转化（real-time quaking-induced conversion, RT-QuIC）已成为最广泛验证且临床影响力最大的方法；蛋白质错误折叠循环扩增（protein misfolding cyclic amplification, PMCA）作为基础性方法学；以及基于超声的体系如板场淀粉样蛋白爆发诱导系统（HANdai Amyloid Burst-Inducer, HANABI），为机制研究和实验研究提供了重要见解。
SAA的显著敏感性依赖于构象模板化原理，即微量错误折叠的αSyn可成核催化单体底物向淀粉样聚集体的转化。过饱和模型（supersaturation model）为扩增过程提供了机制解释：可溶性αSyn以高于其溶解度极限的亚稳态过饱和状态存在，外部扰动如震摇或超声以及种子的存在可克服此过饱和能垒，触发成核和纤维生长。此外，源于结构特异性种子的株相关αSyn纤维的形成反映了不同单体构象如何受化学环境（如离子强度、阳离子或磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸，PIP?）影响而产生结构不同的纤维多态体，这些多态体具有不同的纤维刚度和溶酶体损伤特性。这些发现解释了患者来源样本中SAA产物的多态性多样性，强调SAA不仅检测αSyn种子，还可能传播部分株特异性结构信息。然而，种子结构的忠实复制并不能完全保证，扩增纤维应被解读为种子活性的读数而非确切的结构拷贝。
**RT-QuIC作为病理特异性生物标志物平台**
RT-QuIC通过实现对CSF和外周组织中αSyn种子活性的高敏感性和特异性检测，对该领域产生了变革性影响。RT-QuIC是SAA的新版本，因其速度、实时读数能力以及检测候选纤维抑制剂潜力而广泛应用于αSyn检测。RT-QuIC通过间歇性震摇诱导种子与重组单体蛋白混合物在多孔板中"震摇"，利用荧光淀粉样蛋白结合分子（常用硫黄素T，Thioflavin T, ThT）实现纤维形成的高通量实时监测。阳性RT-QuIC反应通常表现为滞后期的ThT荧光增强，提示样本中存在错误折叠的αSyn种子。由于RT-QuIC可记录动力学信息，其可提供滞后时间、生长速率和最大荧光等定量参数，以更好地表征纤维扩增谱。除动力学读数外，RT-QuIC还可采用终点稀释策略定量估算种子活性，通常以半数种子剂量（seeding dose 50, SD50）表示，通过确定50%重复反应仍为阳性的稀释度来正式度量聚集体负荷。终点稀释RT-QuIC已应用于CSF和外周组织研究，包括近期的胃肠道活检研究，凸显了SAA从二元诊断工具向半定量生物标志物平台演进的潜力。然而，在广泛应用于临床实践之前，定量指标的标准化和实验室间可重复性仍需进一步完善。
早期αSyn RT-QuIC研究证实PD和DLB患者的CSF含有可在体外扩增的αSyn种子，而健康对照或非突触核蛋白病患者的CSF则不具有此特性，从而建立了病理特异性生物标志物检测方法。近期涉及20余项研究的荟萃分析发现，CSF RT-QuIC（以及部分研究中基于PMCA的检测）区分突触核蛋白病（尤其PD和DLB）与对照的总体敏感性为88%，特异性达95%。值得注意的是，这些检测不仅能发现已确诊的PD/DLB，还能检测前驱期病例，例如快速眼动睡眠行为障碍或嗅觉减退等高PD风险个体，在诊断前即常显示阳性种子结果。大型帕金森病进展标志物倡议研究（Parkinson's Progression Markers Initiative, PPMI）中，CSF αSyn RT-QuIC在约88%的确诊PD病例和86%伴有快速眼动睡眠障碍或嗅觉减退的前驱期病例中呈阳性，而在超过96%的健康对照中为阴性。多项独立队列研究已复制并扩展了这些发现，确立了RT-QuIC作为突触核蛋白病稳健且可重复生物标志物平台的地位。
**PMCA：基础性方法学**
PMCA最初用于朊蛋白检测，后适配于αSyn检测。PMCA中，扩增反应由种子与单体反应生成新纤维的孵育期，以及将纤维断裂产生新纤维末端以利后续种子事件的超声脉冲期交替组成，周期性重复以实现纤维扩增。由于PMCA进行错误折叠蛋白的循环扩增，理论上可检测患者样本中极低浓度的αSyn聚集体。冷冻电镜（Cryo-electron microscopy, CryoEM）的关键发现表明，不同疾病中聚集的αSyn存在不同的纤维形态。PD和DLB患者来源的纤维与MSA患者来源的纤维具有不同特性，反映了致病性αSyn株在超微结构水平的差异。这种株行为类似于朊病毒疾病中的发现，为区分不同突触核蛋白病提供了框架。然而，PMCA仍面临挑战，如需专用超声设备、完成时间可能长达数天，且通常为终点检测。
**基于超声的扩增系统：HANABI**
基于超声的扩增系统采用受控声能加速淀粉样蛋白形成。研究人员开发的HANABI系统将超声仪与微孔板读数仪整合，实现了淀粉样纤维形成的自动化高通量监测。超声破坏变性蛋白的过饱和状态，触发淀粉样纤维的成核和生长。近年来，采用合适表面活性剂的方法可选择性抑制初级成核同时促进种子诱导纤维的延伸，使检测痕量预制纤维和研究淀粉样蛋白生成动力学成为可能。目前，HANABI平台主要应用于实验和筛选背景，在临床诊断生物标志物研究中具有潜在应用价值。
**外周组织与检测优化**
除CSF外，RT-QuIC已成功应用于多种生物样本。近期αSyn SAA已能检测嗅黏膜刷检、皮肤活检、血液、唾液腺活检和胃肠道活检中的聚集态αSyn。其中，皮肤活检RT-QuIC对PD诊断的特异性可达85-95%，敏感性达66-91%，优于传统皮肤免疫组织化学。利用外周组织的能力极具价值，为使用安全、可重复、侵入性较小的活检进行分子诊断开辟了可能。然而，外周组织的诊断准确性仍受取样部位、疾病分期、检测条件和株依赖性状的影响，需进一步标准化。
MSA对扩增检测构成挑战。MSA患者在优化检测PD/DLB株的条件下常显示阴性或较慢的RT-QuIC反应，CSF RT-QuIC对MSA的合并敏感性仅约30%。近期研究通过调整反应条件，精细调节不同盐浓度和温度以改善MSA检测，在优化条件下MSA检测敏感性已提高至70-80%，甚至可根据扩增反应动力学特征区分PD与MSA。
近年来，αSyn SAA方案不断精炼以提升速度和实用性。常规αSyn RT-QuIC运行可能需要数天才能获得诊断结果，而新"快速"方案大幅缩短了所需时间。例如，同日RT-QuIC（same-day RT-QuIC, sdRT-QuIC）通过优化震摇速度、温度、突变αSyn底物和洗涤剂，仅在8-12小时内即可完成检测且不影响敏感性。其他创新包括中和血液成分干扰的方法，如Nano-QuIC利用纳米颗粒封存抑制剂，已实现对血液样本中αSyn种子的检测。
**错误折叠αSyn的直接检测方法**
**组织病理学与显微镜检查**
组织显微镜检查是识别突触核蛋白病中蛋白聚集体的首个方法。目前，使用抗αSyn抗体（尤其是特异性识别病理磷酸化αSyn丝氨酸129位点的抗体）的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）是确认脑内路易体的标准方法。死后脑组织检查仍是PD、DLB和MSA确定性诊断的金标准，依赖IHC可视化路易体或胶质细胞包涵体。
在外周组织中，皮肤活检经抗磷酸化αSyn IHC检查，已显示在PD和DLB患者真皮自主神经纤维中存在聚集态αSyn。单次活检IHC的敏感性存在变异，可能因非特异性染色出现假阳性。其他检查的外周组织包括颌下腺和胃肠道（结肠或阑尾活检）。这些IHC方法的关键局限性在于敏感性，许多患者（尤其早期）可能因取样于未受累部位而出现假阴性。
先进显微镜技术增强了这些聚集体的研究。荧光染料如硫黄素S或刚果红可直接结合组织切片中的αSyn淀粉样纤维产生荧光信号。新型淀粉样蛋白结合探针如发光共轭寡噻吩已用于αSyn沉积物的光谱鉴别检测。电子显微镜和超分辨率光镜揭示了路易体的超微结构细节，但这些高分辨率方法主要为研究工具，尚不能用于临床诊断。
值得注意的方法是将免疫捕获与显微镜结合。邻近连接检测等技术通过两个抗αSyn抗体仅在邻近结合时产生荧光信号，实现寡聚体αSyn的原位检测，可在脑组织和皮肤组织中检测经典路易体不可见的少量聚集态αSyn。组织病理学检测可提供突触核蛋白病的直接证据，但其诊断产出强烈依赖取样部位、组织处理和读数方法。
**生化检测**
多种生化检测用于体液中αSyn蛋白的检测。最简单的方法是通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）等免疫检测测定CSF中总αSyn浓度。近期研究表明PD患者CSF总αSyn低于健康对照，这一看似矛盾的下降可用过饱和模型解释：当αSyn聚集时，CSF中可溶性组分随之下降，类似于阿尔茨海默病中Aβ42的现象。
为提高特异性，研究人员聚焦于疾病特异性αSyn形式，如寡聚体或特定翻译后修饰（如磷酸化αSyn）。寡聚体αSyn检测通常使用优先结合αSyn寡聚体的抗体进行ELISA格式检测，显示PD和DLB患者CSF中寡聚体αSyn水平或寡聚体与总αSyn比值升高。质谱（mass spectrometry, MS）是检测αSyn的替代方法，可用于CSF中αSyn定量，并识别突触核蛋白病中的翻译后修饰。MS证实路易体中几乎所有αSyn均在S129位磷酸化，常伴有C末端截断，有时泛素化。质谱成像（mass spectrometry imaging, MSI）可直接在组织切片中映射αSyn分布。
在实际应用中，免疫检测仍是实验室测量αSyn的主要生化工具。近年来，这些检测的敏感性通过单分子阵列（Single Molecule Array, Simoa）数字免疫检测等技术得到提高。Simoa通过分离计数飞升级别孔中的单个结合事件，可检测比传统ELISA低数个数量级的蛋白浓度。研究人员已将该技术适配用于特异性检测聚集态αSyn，可检测亚皮摩尔水平的聚集态αSyn。类似地，血浆细胞外囊泡中pS129 αSyn的Simoa检测试图从血液背景中富集脑源性组分。
神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）虽不特异于突触核蛋白病，但作为神经元损伤的通用标志物已成为帕金森综合征的有价值生物标志物。NfL通常在PD和DLB中正常或仅轻度升高，但在MSA等非典型帕金森病理中显著升高，有助于鉴别路易体型PD（低NfL）与MSA或进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy, PSP）（高NfL）。NfL与αSyn特异性生物标志物联合使用具有价值：RT-QuIC阳性+低NfL提示PD；RT-QuIC阴性+高NfL提示MSA/PSP。
**神经影像：PET与MRI**
突触核蛋白病的理想检测方法应为非侵入性影像策略，能在活体脑中可视化αSyn聚集体，以确定其在患者脑中的分布，辅助诊断并追踪疾病进展和药物疗效。研究人员已投入大量努力开发αSyn正电子发射断层成像（positron emission tomography, PET）示踪剂，取得一些有前景的初步结果。
设计αSyn PET放射性配基具有挑战性，因为靶点αSyn聚集体通常为细胞内、分布广泛但密度低于细胞外淀粉样斑块，且β-折叠含量低于淀粉样蛋白Aβ或tau，意味着为阿尔茨海默病设计的配基不一定能适当结合αSyn聚集体。早期候选物如[11C]PBB3主要结合tau，仅在高位点浓度时对αSyn包涵体显示弱结合。但新的小分子示踪剂正在临床或临床前评估中。例如，[18F]ACI-12589显示选择性结合αSyn沉积，在MSA患者脑中有特定滞留，尤其在小脑和纹状体黑质区域，而在其他神经退行性疾病中结合最小，可能区分MSA与其他突触核蛋白病。其他候选示踪剂包括多种二苯乙烯、联苯和苯并噁唑衍生物，部分已进入人体扫描和剂量学阶段。
与此同时，磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）技术用于检测蛋白聚集的后果。常规MRI不能直接可视化αSyn蛋白，但可揭示突触核蛋白病患者的结构和功能改变。PD和DLB通常显示黑质体积丢失，而MSA常显示壳核、脑桥和小脑萎缩及胶质增生。神经黑色素敏感MRI可检测黑质致密部多巴胺能神经元丢失导致的脱色，PD患者黑质和蓝斑的正常神经黑色素MRI信号降低。弥散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）评估微结构完整性，脑干和基底节弥散指标变化可区分PD、MSA和PSP。铁敏感MRI（磁敏感加权成像susceptibility-weighted imaging, SWI或定量磁化率定量susceptibility mapping）常显示PD患者黑质铁积累增加，MSA壳核铁显著增高。
多巴胺转运体（dopamine transporter, DaT）SPECT扫描广泛用于确认多巴胺能神经元丢失，可提示帕金森综合征，但不能区分PD、MSA或DLB。有助于区分的核医学方法是心脏交感神经成像，使用
123I-MIBG闪烁显像。PD和DLB导致心脏交感神经退变（因自主神经节中αSyn沉积），心脏MIBG摄取降低；而MSA通常保留外周心脏神经。心脏MIBG扫描对区分PD与MSA显示了高敏感性和特异性，在某些地区已纳入DLB诊断标准。
**生物传感器与新型检测策略**
**单分子检测技术**
研究人员已证明使用纳米孔设备检测单个αSyn寡聚体，通过纳米级孔道传递蛋白并监测离子电流扰动，寡聚体αSyn引起特征性离子电流变化可区别于单体。表面荧光强度分布分析（surface fluorescence intensity distribution analysis, sFIDA）是另一种可检测单个αSyn聚集体的数字计数检测，聚集体被表面固定抗体捕获后荧光标记，每个聚集体产生荧光信号，通过计数光点可定量聚集体浓度。应用于CSF时，sFIDA显示PD和DLB患者αSyn聚集体计数高于对照。
**工程细胞系统**
工程细胞系统常作为活体生物传感器，其产生可检测信号以响应摄取的错误折叠αSyn。这些细胞系通常表达与分裂萤光素酶片段融合的αSyn，仅在αSyn寡聚化时重组发光。暴露于含种子的样本时，细胞产生荧光或发光信号，作为种子活性的活体生物传感器，补充RT-QuIC等体外检测。这些检测也可调整以检测不同株。
**生物流体生物传感器**
一些团队开发用于αSyn的电化学和光学传感器。有趣的方法使用适配体（aptamers），即结合αSyn聚集体的短DNA或RNA序列。报道的基于适配体的光学生物传感器中，染料标记的DNA适配体结合αSyn后荧光改变，在氧化石墨烯表面进行检测以猝灭背景荧光，实现了缓冲液中αSyn的敏感检测。在电化学方面，研究人员创建了纳米结构电极上的免疫传感器。例如，合成作为塑料抗体的表面印迹聚合物，具有特异性匹配αSyn形状的腔隙，置于电极上可结合αSyn并改变电化学阻抗，实现极低浓度检测。有机电化学晶体管（organic electrochemical transistor, OECT）搭载αSyn适配体，可检测低至10飞克/升的αSyn单体。
生物传感器旨在最终提供快速、微创的错误折叠αSyn检测，可在临床进行。它们仍处于实验阶段，尚无任何一种经过CSF检测或影像学的验证，但代表了诊断技术的前沿。纳米技术、新型结合分子和微流控的结合不断提高检测限。例如，将扩增与传感器结合，如在微流控芯片中进行RT-QuIC并实时光学读数，可能缩短检测时间并实现自动化。
