《Advanced NanoBiomed Research》：Biomimetic Nanoparticle Delivering Colchicine to Target Endothelial Inflammation for Atherosclerosis Treatment
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功能失调的内皮伴随慢性炎症是动脉粥样硬化斑块形成的早期阶段。能够靶向活化内皮并缓解炎症的纳米药物在动脉粥样硬化治疗中具有重要潜力。本研究构建了仿生血小板膜包被层状双金属氢氧化物（layered double hydroxide, LDH）纳米颗粒（PM-LDH
功能失调的内皮伴随慢性炎症是动脉粥样硬化斑块形成的早期阶段。能够靶向活化内皮并缓解炎症的纳米药物在动脉粥样硬化治疗中具有重要潜力。本研究构建了仿生血小板膜包被层状双金属氢氧化物（layered double hydroxide, LDH）纳米颗粒（PM-LDH），用于抗炎药物秋水仙碱的靶向递送至炎症内皮细胞，并证实载药PM-LDH可改善治疗效果。受血小板与活化内皮天然相互作用启发，血小板膜包被纳米颗粒对炎症内皮细胞表现出显著高亲和力，同时降低巨噬细胞的免疫清除。该体系可减少炎症内皮细胞中单核细胞募集并抑制活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成，从而增强抗炎功效。综上，借助血小板膜-内皮相互作用，该仿生载秋水仙碱纳米颗粒有望成为动脉粥样硬化的靶向治疗策略。
研究背景与意义
动脉粥样硬化是导致卒中、心肌梗死等心血管事件的主要病理基础，每年造成全球超过1790万人死亡。其本质是慢性血管炎症性疾病，特征为富含胆固醇的脂蛋白在血管壁沉积并诱发炎症级联反应，最终形成血管内膜下的脂质斑块。血管内皮作为血液与血管壁的屏障，在脂质沉积后发生功能障碍，触发免疫激活并促进血小板通过血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）与血小板糖蛋白的分子互作黏附于受损内皮。随后血小板活化释放多种介质，招募单核细胞与白细胞至内皮表面，这一过程被视为动脉粥样硬化发生的起始环节。因此，靶向内皮炎症是防治动脉粥样硬化的关键策略，但目前针对内皮炎症的特异性治疗手段仍十分有限。
秋水仙碱是一种传统用于治疗痛风性关节炎与家族性地中海热的药物，近期已被批准作为首个抗炎药物用于已确诊或高危动脉粥样硬化性心血管疾病患者。其作用机制为直接抑制微管聚合及黏附分子表达，从而干扰白细胞向炎症组织募集与黏附，通过降低内皮活化和抑制级联炎症反应调控动脉粥样硬化进程。多项临床试验（如LoDoCo试验）显示低剂量秋水仙碱可显著降低心血管事件风险，但国际CLEAR SYNERGY试验结果未观察到不良心血管事件的显著减少，仅非心血管死亡率有所下降。最新荟萃分析表明，低剂量秋水仙碱可降低动脉粥样硬化患者的非致死性缺血事件风险，但对心血管或非心血管死亡率无显著影响。这种临床疗效异质性提示，尽管秋水仙碱具有抗炎与斑块稳定作用，仍需进一步提升其治疗效果。既往研究表明，动脉粥样硬化斑块内的血管炎症在斑块进展及不良心血管事件中至关重要，提高病灶局部抗炎药物浓度有望改善疗效。因此，开发可实现秋水仙碱病灶特异性递送的策略，可在增强抗动脉粥样硬化疗效的同时减少全身暴露与潜在不良反应。基于纳米颗粒的药物递送系统为实现秋水仙碱向动脉粥样硬化病灶的靶向递送提供了可行平台。
针对上述需求，研究人员构建了仿生血小板膜包被层状双金属氢氧化物（PM-LDH）纳米颗粒，用于向炎症内皮细胞递送秋水仙碱，以治疗动脉粥样硬化。LDH是由带正电的类水镁石金属氢氧化物层与层间阴离子及水分子构成的生物可降解、生物相容性纳米材料，可通过静电作用与氢键结合药物分子。细胞膜包被技术是新兴的仿生纳米医学策略，通过将纳米颗粒核心包裹细胞细胞膜，可模拟源细胞特性并实现高效生物界面功能。受动脉粥样硬化早期血小板黏附于功能失调内皮的自然现象启发，本研究采用血小板膜功能化载秋水仙碱LDH（Col-LDH）纳米颗粒，以实现对炎症内皮细胞的靶向递送。本研究发表于《Advanced NanoBiomed Research》。
主要技术方法
研究人员首先通过共沉淀法合成Col-LDH，采用紫外-可见吸收光谱（UV–vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高效液相色谱（HPLC）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、粉末X射线衍射（XRD）表征其理化性质。随后采用牛血清白蛋白（BSA）预包被Col-LDH，并通过挤出法与血小板膜囊泡融合，制备PM-BSA-Col-LDH，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证膜包被成功。体外实验采用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导建立炎症内皮模型，通过荧光成像与流式细胞术评估纳米颗粒的结合与摄取效率。采用佛波酯（PMA）诱导人单核细胞系THP-1分化为巨噬细胞，评估纳米颗粒的免疫逃逸能力。通过活性氧探针DCFH-DA染色、线粒体膜电位JC-1染色、单核细胞黏附实验及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症内皮细胞中ROS水平、线粒体功能、单核细胞黏附及黏附分子表达，评价治疗效果。所有数据均采用GraphPad Prism软件进行统计学分析。
研究结果
2.1 血小板膜包被载秋水仙碱层状双金属氢氧化物纳米颗粒的理化性质
2.1.1 Col-LDH纳米颗粒的理化性质
Col-LDH通过金属离子、碱与秋水仙碱在室温下共沉淀合成，TEM显示为片状形貌，粒径约50 nm；DLS测得流体力学粒径平均227 nm，多分散指数（polydispersity index, PDI）为0.25，分散性良好。UV–vis与FTIR光谱均证实秋水仙碱成功负载于LDH。HPLC定量显示Col-LDH的载药量为15.1%，载药效率为9.0%。Col-LDH的Zeta电位为+31.8 mV，略低于纯LDH（+36.4 mV），归因于秋水仙碱的负电基团部分中和LDH表面正电荷，同时秋水仙碱的三甲氧基苯环与环庚三烯酮环上的甲氧基氧原子可与LDH层间羟基形成氢键。XRD结果显示Col-LDH维持LDH典型层状结构，晶面间距略有扩大，层数由5.14减少至4.78，提示秋水仙碱负载引起LDH部分剥离与层间距扩张。
2.1.2 血小板膜包被Col-LDH纳米颗粒的理化性质
Col-LDH先经BSA预包被以提高稳定性，再经挤出法与血小板膜囊泡融合获得PM-BSA-Col-LDH。DLS显示其平均粒径为237 nm，PDI为0.25，略大于Col-LDH；在未包被状态下，Col-LDH在电解质溶液中严重聚集（平均粒径5052 nm），而PM-BSA-Col-LDH在PBS中保持稳定，归因于血小板膜的位阻效应抑制了电解质环境下的聚集。Zeta电位由+31.8 mV降至BSA包被后的?18.2 mV，进一步降至膜包被后的?24.3 mV，表明表面修饰成功。SDS-PAGE检测到血小板特异性蛋白条带，验证了血小板膜的成功包被。
2.2 体外靶向炎症内皮细胞
MTT实验显示，25 nM及以下浓度的秋水仙碱及各载药纳米颗粒对HUVEC活力无显著影响，选用25 nM进行后续实验。在冰浴条件下，Cy5.5标记的PM-BSA-Col-LDH与炎症HUVEC孵育30秒至30分钟，荧光强度随时间显著升高，表明其可快速、高效地靶向炎症内皮细胞，该过程由血小板表面糖蛋白（如GPIb）与活化内皮vWF的特异性互作介导。在37°C条件下，PM-BSA-Col-LDH可被炎症内皮细胞快速摄取，流式细胞术显示孵育0.5、1、2小时后分别有68.4%、83.4%、97.3%的细胞呈荧光阳性，显著高于未包被组的33.1%、41.1%、89.0%，证实血小板膜包被可有效增强炎症内皮细胞对纳米颗粒的摄取。
2.3 体外巨噬细胞免疫逃逸能力
采用THP-1分化巨噬细胞模拟免疫系统，孵育1小时后，PM-BSA-LDH组仅11.2%的巨噬细胞呈荧光阳性，显著低于BSA-LDH组的26.5%，表明血小板膜包被可有效降低纳米颗粒被巨噬细胞吞噬清除的风险，延长血液循环时间。
2.4 体外对炎症内皮细胞的治疗效果
采用脂多糖（LPS）激活HUVEC模拟动脉粥样硬化早期炎症，DCFH-DA染色显示PM-BSA-Col-LDH可显著降低细胞内ROS水平，效果略优于游离秋水仙碱。JC-1染色显示，PM-BSA-Col-LDH可更有效地恢复线粒体膜电位，提示其通过清除ROS改善线粒体功能。单核细胞黏附实验显示，PM-BSA-Col-LDH可显著减少单核细胞在炎症内皮表面的黏附，ELISA结果进一步证实其可下调血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）与细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，表明该纳米体系通过抑制黏附分子表达减少单核细胞募集。
讨论与结论
本研究证实血小板膜包被Col-LDH纳米颗粒是一种极具潜力的动脉粥样硬化治疗平台。LDH通过氢键实现秋水仙碱的高效负载，血小板膜包被则显著提高了纳米颗粒在生理条件下的胶体稳定性。细胞实验表明，PM-BSA-LDH通过血小板膜糖蛋白与炎症内皮vWF的特异性结合实现快速靶向，随后经胞吞作用进入细胞，该过程显著优于未包被纳米颗粒。治疗评估显示，PM-BSA-Col-LDH可更高效地清除ROS并恢复线粒体功能，同时通过下调黏附分子表达抑制单核细胞黏附，从而在炎症病灶部位实现精准抗炎，减少全身毒副作用。
本研究局限性在于尚未明确血小板表面蛋白与内皮受体互作的具体配体-受体对，也未开展人动脉粥样硬化斑块样本的外植体研究，未来需通过类器官芯片等技术进一步评估其斑块穿透能力、药代动力学、体内分布及治疗效应。
结论部分指出，本研究开发的仿生载秋水仙碱LDH纳米颗粒可通过血小板膜包被显著提高生理条件下的胶体稳定性，借助血小板对炎症内皮的天然亲和力，实现对活化内皮的高效靶向、增强细胞摄取并减少免疫细胞吞噬。体外治疗研究显示，该仿生纳米颗粒具有更强的ROS清除能力与线粒体功能恢复作用，并可下调单核细胞黏附及相关黏附分子表达。综上，血小板膜包被载秋水仙碱纳米颗粒有望通过精准靶向递送，显著提升秋水仙碱抗动脉粥样硬化的治疗效果。
