《Journal of Virological Methods》：Development and validation of a one-step RT-ddPCR assay for sensitive and absolute quantification of foot-and-mouth disease virus RNA in probang fluid
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金卡恩·布努苏亚·塞约（Kingkarn Boonsuya Seeyo）、诺茨·科苏克（Kosuke Notsu）、纳利妮·洪楚蓬（Nalinee Hongchumpon）、吉兰南特·乔蒂坎蓬（Jeeranant Chottikamporn）、松井勇人（Yuto Matsui）、
金卡恩·布努苏亚·塞约（Kingkarn Boonsuya Seeyo）、诺茨·科苏克（Kosuke Notsu）、纳利妮·洪楚蓬（Nalinee Hongchumpon）、吉兰南特·乔蒂坎蓬（Jeeranant Chottikamporn）、松井勇人（Yuto Matsui）、贾尼亚·萨马尼特（Janya Samanit）、阿隆科恩·潘图马特（Alongkorn Pantumart）、帕里查特·甘松萨克（Parichat Ngansomsak）、广川玛丽（Mari Hirokawa）、山田健太郎（Kentaro Yamada）、勒德柴·钦塔皮塔克萨库尔（Lerdchai Chintapitaksakul）、三泽直明（Naoaki Misawa）泰国帕乔翁（Pakchong）东南亚地区口蹄疫参考实验室，邮编30130
摘要
口蹄疫（FMD）是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高度传染性的偶蹄动物疾病。FMDV可以在临床康复的牛只采集的唾液样本中以低水平存在，这给敏感检测和定量带来了挑战。在这项研究中，我们开发并验证了一种一步法逆转录滴液数字PCR（RT-ddPCR）检测方法，用于检测和绝对定量FMDV RNA。通过将RT-ddPCR的分析性能与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的RT-qPCR方法进行比较，证明了其有效性。RT-ddPCR显示出高分析灵敏度，能够清晰区分阳性与阴性样本，并且与RT-qPCR的结果具有很强的定量一致性（皮尔逊相关系数r = 0.997，p < 0.05）。RT-ddPCR的分析灵敏度与RT-qPCR相当，能够检测到低至1 × 10^0 TCID50/ml的FMDV RNA。实验内的重复性较低，而不同实验之间的再现性在RT-ddPCR和RT-qPCR之间相当。将RT-ddPCR应用于FMD爆发后6个月和10-11个月采集的唾液样本时，发现部分临床康复的牛只中仍存在可检测水平的FMDV RNA。这些结果表明，一步法RT-ddPCR能够敏感地检测和绝对定量低水平的FMDV RNA，是研究病毒持续存在和亚临床排毒情况的宝贵工具。
引言
口蹄疫（FMD）是一种影响偶蹄动物（包括牛、猪、羊和山羊）的高度传染性病毒性疾病（Jamal和Belsham，2013）。致病因子口蹄疫病毒（FMDV）属于疱疹病毒科（Picornaviridae）中的Aphthovirus属（Zell等人，2017），其特征是传播迅速且能够引发大规模疫情，造成重大经济损失（Knight-Jones和Rushton，2013；Humphreys等人，2025）。尽管FMD已在多个地区被根除并保持无疫状态，但该病毒在非洲、亚洲和中东的大部分地区仍然流行，跨境传播事件不断威胁着无疫国家（Brito等人，2017）。因此，FMD仍然是影响全球畜牧业生产和国际贸易的最重要的跨境动物疾病之一（Knight-Jones和Rushton，2013；Humphreys等人，2025）。
在看似临床康复后，FMDV可能在没有明显临床症状的情况下在感染反刍动物的上呼吸道中持续存在，形成所谓的携带状态。感染性病毒和/或病毒RNA的持续存在在牛中的情况记录最为广泛，FMDV可能在感染后持续数月，偶尔甚至超过24个月（Alexandersen等人，2003；Arzt等人，2011；Arzt等人，2020；Stenfeldt等人，2016）。相比之下，猪中的持续感染尚未得到充分证实，而小反刍动物中的持续感染记录较少。尽管携带牛的流行病学意义尚未完全明了，但低水平病毒RNA的长期存在对监测和疫情后监控提出了重要挑战。
唾液（口咽）样本被广泛用于检测牛中的持续FMDV感染（Alexandersen等人，2003；Arzt等人，2020）。然而，在唾液样本中进行可靠的分子检测在技术上具有挑战性，因为病毒RNA水平通常极低且可能随时间波动（Stenfeldt等人，2016）。此外，唾液样本采集和处理的变异性可能进一步增加低拷贝数结果的解读难度。因此，需要高度敏感和稳健的分子方法来长期监测和检测携带牛中的持续FMDV RNA。
世界动物卫生组织（WOAH，前称OIE）在其《陆生动物诊断测试和疫苗手册》（WOAH，2022）中制定了国际公认的FMD诊断标准。推荐的实验室方法包括病毒分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录定量PCR（RT-qPCR）。在这些方法中，RT-qPCR在分子诊断中起着核心作用，因为它能够在血清转化或临床症状出现之前快速、敏感地检测到FMDV RNA（Reid等人，2003）。虽然检测到病毒RNA并不一定意味着存在感染性病毒，但分子检测方法仍然是FMD监测和疫情控制的重要工具。然而，RT-qPCR依赖于外部标准曲线进行定量，且检测性能可能受到扩增效率变化和低拷贝数随机效应的影响。
逆转录滴液数字PCR（RT-ddPCR）作为一种有前景的替代或补充方法，用于核酸检测和定量。与RT-qPCR不同，RT-ddPCR通过样本分区和终点分析实现病毒RNA拷贝数的绝对定量，无需外部标准曲线（Huggett等人，2015）。这一特性可能提高对低拷贝数目标的检测灵敏度和再现性，使其特别适用于涉及持续低水平病毒RNA检测和长期监测的研究。
迄今为止，只有少数研究评估了RT-ddPCR在FMD诊断中的适用性。Pinheiro-de-Oliveira等人（2018）使用RT-ddPCR对多种血清型的FMDV RNA进行了高度敏感和特异的检测。然而，他们的方案采用了包括单独cDNA合成和PCR扩增的两步工作流程，增加了劳动需求和交叉污染的风险。
在本研究中，我们开发并评估了一种一步法RT-ddPCR检测方法，用于检测和绝对定量FMDV RNA。我们将RT-ddPCR的分析性能与WOAH推荐的RT-qPCR方法进行了比较，并将其应用于泰国FMD爆发后从自然感染的牛只中纵向采集的唾液样本。该研究旨在评估RT-ddPCR在检测和监测现场来源唾液样本中低水平FMDV RNA方面的实用性。
章节片段
病毒株
为了评估RT-ddPCR和RT-qPCR方法的灵敏度和检测限（LOD），使用了FMDV株O/Ind2001e。该株被WOAH认定为参考株，广泛用于方法验证和性能评估。
从FMD康复的牛只中采集唾液样本
2023年12月至2024年1月期间，泰国FMD疫区的三个农场共诊断出30头牛感染了FMD，其中2023年12月有一个农场有10头牛感染，2024年1月有两个农场各有10头牛感染。
一步法RT-ddPCR的分析灵敏度
使用10倍系列稀释的FMDV（O/Ind2001e株）RNA评估了一步法RT-ddPCR的分析灵敏度。阳性与阴性样本之间的阈值手动设定在5000至6000个荧光幅度单位之间，如图1中的水平粉红线所示。在不同稀释度下均观察到阳性与阴性样本之间的清晰分离，从而能够可靠地区分低水平的病毒RNA信号。
讨论
在这项研究中，我们开发并评估了一种一步法RT-ddPCR检测方法，用于检测和绝对定量FMDV RNA，并将其应用于泰国FMD爆发后从自然感染的牛只中采集的唾液样本。该方法与WOAH推荐的RT-qPCR方法具有很强的定量相关性，同时具有无需依赖外部标准曲线的绝对定量优势。该方法的应用使得能够检测到
CRediT作者贡献声明
诺茨·科苏克（Kosuke Notsu）：撰写初稿、正式分析、数据管理。纳利妮·洪楚蓬（Nalinee Hongchumpon）：正式分析。勒德柴·钦塔皮塔克萨库尔（Lerdchai Chintapitaksakul）：资金获取。三泽直明（Naoaki Misawa）：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。金卡恩·布努苏亚·塞约（Kingkarn Boonsuya Seeyo）：撰写初稿、正式分析、数据管理。吉兰南特·乔蒂坎蓬（Jeeranant Chottikamporn）：正式分析。松井勇人（Yuto Matsui）：正式分析。贾尼亚·萨马尼特（Janya Samanit）：正式分析。广川玛丽（Mari Hirokawa）：正式分析。山田健太郎（Kentaro Yamada）：正式分析。
动物研究声明
所有动物实验程序，包括从活牛中采集唾液样本，均符合泰国动物福利法及相关法规。研究方案已得到泰国国家动物健康研究所的机构动物护理和使用委员会的审查和批准（批准编号EA-006/68(R)）。在采样过程中，我们尽一切努力减少动物的不适和压力。
资金
本研究得到了科学技术研究可持续发展合作项目（SATREPS）的支持，该项目是由日本科学技术机构（JST，JPMJSA1908）和日本国际协力机构（JICA）共同开展的。资助方未参与研究设计、数据收集、分析、出版决策或手稿准备。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢JST和JICA的资助。同时感谢泰国畜牧业发展部口蹄疫参考实验室（RRL-FMD）的工作人员在样本准备和提供泰国FMD常规诊断数据方面的支持。
