《Materials Today Bio》：Polyelectrolyte nanoparticles enable intracellular delivery of STING protein fragments for ovarian cancer immunotherapy
编辑推荐：
干预干扰素基因刺激因子（STING）信号传导被认为是诱导肿瘤微环境炎症化并产生抗肿瘤免疫应答的有前景策略。许多人类肿瘤中STING表达的频繁缺失，使小分子激动剂在癌细胞中失效。研究人员此前已证明，将STING蛋白的一个片段——STINGΔTM——递送至胞质（c
干预干扰素基因刺激因子（STING）信号传导被认为是诱导肿瘤微环境炎症化并产生抗肿瘤免疫应答的有前景策略。许多人类肿瘤中STING表达的频繁缺失，使小分子激动剂在癌细胞中失效。研究人员此前已证明，将STING蛋白的一个片段——STINGΔTM——递送至胞质（cytosol）可绕过这一障碍，方法是直接激活胞质中的下游信号分子；然而，要使该策略具有治疗活性，仍需要一种高效的胞质蛋白递送载体。在本研究中，研究人员开发了一种可降解聚阳离子聚(β-氨基酯)（poly(β-amino ester), PBAE）纳米颗粒制剂，用于靶向卵巢癌并将具有生物活性的STINGΔTM蛋白递送至胞质。筛选实验显示，提高PBAE疏水性可实现高效蛋白包封及胞质递送。随后，研究人员开发了一种pH偏移介导的组装方法，以构建由STINGΔTM蛋白、PBAE和聚阴离子组成的、更小且带负电的纳米颗粒。该聚阴离子能够在体外调控STING信号激活的细胞类型特异性，其中聚(L-谷氨酸)和聚(L-天冬氨酸)优先在卵巢癌细胞中激活信号传导。在同系小鼠卵巢癌模型中，纳米颗粒优先蓄积于整个腹腔内的肿瘤部位，减缓肿瘤生长并延长生存期。总体而言，肿瘤靶向PBAE纳米颗粒的开发使得通过直接细胞内递送STING蛋白来治疗卵巢癌成为可能，形成了一种对STING失调癌症具有应用前景的免疫治疗策略。
该文发表于《Materials Today Bio》。研究围绕STING信号失活背景下卵巢癌免疫治疗难题展开。STING（stimulator of interferon genes，干扰素基因刺激因子）通路是连接胞质DNA感知与I型干扰素应答的关键天然免疫轴，在激活抗肿瘤免疫、促进T细胞募集及改善肿瘤免疫原性方面具有重要作用。然而，现有小分子STING激动剂依赖肿瘤细胞自身保留可响应的STING蛋白，而多种人类癌症，尤其高级别卵巢癌中常存在STING表观遗传沉默或表达缺失，导致传统STING激动剂在癌细胞内失效。与此同时，卵巢癌常于晚期发现，腹腔广泛播散转移显著增加了系统递送和病灶靶向的难度。因此，开发能够绕过内源性STING缺陷、并在腹腔转移灶中有效起效的治疗策略，具有明确的临床必要性。
此前研究已提出利用缺失跨膜结构域的重组STING胞质片段STINGΔTM实现下游直接激活。该蛋白片段在进入胞质并形成多聚体后，可直接作用于TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3），从而启动I型干扰素及相关趋化因子的转录。该机制绕过了上游STING缺失这一核心障碍。不过，STINGΔTM若无合适载体，难以进入胞质并接触其靶分子，因此蛋白胞质递送体系成为该策略能否转化的关键。研究人员据此设计了以聚(β-氨基酯)（PBAE）为核心的蛋白纳米递送体系，并尝试借助聚阴离子组分赋予卵巢癌偏向性。
研究首先从PBAE结构性质入手，系统筛选不同聚合物对STINGΔTM递送能力的影响。结果表明，PBAE疏水性升高与STINGΔTM功能性递送效率增强密切相关。最疏水的Poly3可在体外有效将STINGΔTM递送入胞质，并诱导IRF依赖性报告信号升高，提示其具备促进蛋白包封和跨膜递送的潜力。进一步的动态光散射（DLS）与荧光共振能量转移（FRET）分析显示，STINGΔTM与Poly3在酸性条件下混合时并不立即形成稳定纳米复合物，而在pH升高至接近生理条件后，体系散射强度显著增加并伴随FRET增强，说明纳米颗粒形成与STINGΔTM多聚化同步发生。也就是说，Poly3不仅承担递送载体作用，还促进了STINGΔTM从低活性状态向可激活下游信号的多聚状态转变，这是该系统得以发挥功能的重要分子基础。
然而，初始Poly3/STINGΔTM颗粒虽具备体外活性，但粒径偏大、聚集明显且批次一致性欠佳，不利于体内应用。为改进这一问题，研究人员引入聚阴离子，建立了基于pH偏移的三元组装方法。通过在pH转换过程中同时加入聚(L-天冬氨酸)（PLD）等聚阴离子，获得了粒径小于200 nm、分散性较好、表面带稳定负电荷的纳米颗粒。冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）显示该类颗粒形貌较均一；天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）迁移实验则表明STINGΔTM几乎被完全包封。该结果说明，聚阴离子的加入显著优化了颗粒胶体稳定性和物理化学性质，为后续体内递送奠定基础。
在此基础上，研究继续考察不同聚阴离子对细胞类型特异性的影响。作者比较了PLD、聚(L-谷氨酸)（PLE）、聚丙烯酸（PAA）、葡聚糖硫酸（DS）及PLD-PEG等多种组分。结果发现，聚阴离子不仅影响颗粒表面电性和粒径，更显著改变STING信号激活的细胞谱系偏向。含PLE或PLD的纳米颗粒在卵巢癌细胞中保持较强活性，而在髓系免疫细胞中活性较低，体现出较好的卵巢癌细胞偏向性；相反，DS体系在卵巢癌细胞中的功能性递送很弱，PAA则更倾向保留在免疫细胞中的活性。这些结果提示，聚阴离子并非单纯稳定辅料，而是可作为调控生物界面识别和功能递送选择性的关键模块。综合颗粒形成稳定性、腹水环境中的保持能力及卵巢癌偏向性，研究最终选择PLD制剂用于后续体内验证。
在方法上，研究主要采用以下关键技术：其一，构建并筛选不同疏水性PBAE材料，结合IRF报告基因体系评价STINGΔTM胞质功能递送；其二，利用pH偏移组装、动态光散射（DLS）、Zeta电位、负染及冷冻透射电镜（Cryo-TEM）、天然PAGE和FRET表征纳米颗粒形成、包封与蛋白多聚化；其三，在人源和鼠源卵巢癌细胞系及免疫细胞中，通过ELISA和报告基因检测CXCL10、IFN-β与IRF3活化；其四，采用C57BL/6小鼠腹腔注射Luc
+ BPPNM同系卵巢癌模型，结合活体成像系统（IVIS）与冷冻荧光断层成像（CFT）评估腹腔转移灶分布、肿瘤负荷与生存获益。
研究结果部分可概括如下。
A hydrophobic PBAE delivers STINGΔTM to cytosol
研究人员首先证明，PBAE的疏水性是STINGΔTM有效递送的决定因素之一。通过多种PBAE比较，发现Poly3在IRF报告细胞中诱导最强的功能性信号，说明其最能将活性STINGΔTM送入胞质。DLS结果表明，STINGΔTM与Poly3只有在pH由5.2转至7.2后才形成明显颗粒；FRET结果则显示这一过程中STINGΔTM分子间接近程度提高，证明颗粒形成同时驱动蛋白多聚化。由此得出结论：疏水性增强的PBAE可在近生理pH条件下促成STINGΔTM包封与活化，为后续制剂设计提供了核心原则。
Incorporation of a polyanion in PBAE nanoparticles
在确认Poly3具有递送潜力后，研究人员通过引入聚阴离子改善制剂性能。PLD加入后，纳米颗粒粒径显著缩小至亚200 nm范围，分散性提高，表面转为稳定负电。Cryo-TEM证实颗粒较均一，Native PAGE证实STINGΔTM几乎完全包封。此外，该制剂在生理离子强度条件下24 h内保持胶体稳定。由此可见，聚阴离子整合进PBAE体系后，解决了原始Poly3颗粒粒径大、聚集重和批次不稳定的问题。
Polyanions alter cellular specificity of STING activation
研究进一步比较不同聚阴离子所带来的细胞类型差异。通过在人和小鼠卵巢癌细胞、髓系细胞及HEK293T细胞中的功能测定发现，PLE和PLD最能维持卵巢癌细胞中的STING激活，而DS在卵巢癌细胞中几乎不具活性，PAA则更偏向免疫细胞。此结果说明，聚阴离子组分可调控纳米颗粒的功能性递送特异性，而不仅仅影响物理性质。PLD因此被确定为兼顾卵巢癌偏向、颗粒稳定及腹水环境耐受性的最优组分。
PBAE nanoparticles accumulate in metastases throughout the abdomen
在同系BPPNM卵巢癌腹腔转移模型中，研究人员比较了Poly3、DS和PLD三种纳米颗粒的体内分布。IVIS与器官离体成像表明，各类纳米颗粒均能在网膜等肿瘤富集器官中获得较高蓄积，并与多处腹腔转移灶良好共定位。与无聚阴离子Poly3颗粒相比，加入PLD或DS后，肿瘤相关器官中的在位蓄积上升，而肠道等非靶部位蓄积下降。CFT进一步从整体三维层面验证，载药颗粒可在腹腔广泛转移病灶内聚集。研究据此认为，腹腔给药的PBAE纳米颗粒具有良好的腹腔转移灶靶向能力，而聚阴离子的加入有助于改善整体器官分布趋势。
STINGΔTM delivery with PBAE nanoparticle has therapeutic efficacy in ovarian cancer models
最后，研究验证了该体系的治疗潜力。Western blot显示，多种卵巢癌细胞存在STING低表达或缺失。将PLD/Poly3纳米颗粒负载STINGΔTM后处理这些细胞，可显著提高CXCL10分泌；与失活突变体STINGΔTM S365A相比，活性蛋白递送产生更强信号，说明疗效依赖STINGΔTM对IRF3轴的特异性激活。值得注意的是，在SKOV3和A2780等对小分子STING激动剂ADU-S100无应答的细胞中，该纳米颗粒仍能触发明显反应，证明其确能绕过内源性STING缺陷。在BPPNM小鼠模型中，STINGΔTM纳米颗粒腹腔注射治疗可减缓肿瘤增长，并将中位生存期延长约1周，生存获益约22%。治疗过程中未观察到明显体重恶化，也未检出显著血清CXCL10或IFN-β升高，提示在当前给药条件下未见明显全身性炎症激活信号。
讨论部分指出，本研究的主要创新在于：其一，明确了通过提高PBAE疏水性，可实现STINGΔTM的高效包封、胞质递送和活性多聚化；其二，建立了pH偏移驱动的PBAE/聚阴离子/STINGΔTM三元纳米组装策略，使颗粒具备更适于体内应用的负电荷、小粒径和稳定性；其三，证明聚阴离子成分可重塑功能性递送的细胞特异性，其中PLD和PLE在卵巢癌靶向方面表现突出；其四，完成了从体外机制验证到体内肿瘤靶向及疗效评估的概念验证。研究也指出，目前疗效幅度仍较温和，仅实现肿瘤生长减缓和有限生存延长，尚需进一步优化纳米颗粒效力、提升长期稳定性，并在更多模型中验证机制与安全性。
研究结论部分可译为：研究人员开发了一种用于将STINGΔTM蛋白递送至胞质的纳米颗粒载体，使其能够作为卵巢癌免疫治疗策略应用，并最终在卵巢癌小鼠模型中显示出肿瘤特异性蓄积及适度的生存延长。既往工作已表明，胞质递送STINGΔTM可在体外激活所需的先天免疫信号，而本研究进一步证明了该策略在体内应用的可行性。为构建有效的纳米颗粒制剂，研究发现提高PBAE疏水性可促进STINGΔTM包封及其向胞质的功能性递送。研究还建立了一种基于pH偏移的纳米颗粒组装方法，可同时将聚阴离子整合进PBAE纳米颗粒中，形成带负电且稳定的颗粒。PLD和PLE两种聚阴离子可在细胞水平改善STING信号激活对卵巢癌的靶向性。本研究推动了对胞质STING蛋白片段递送作为免疫治疗策略的进一步探索，并提示即使在STING信号失调背景下，该策略仍具有应用前景。
