基因组编辑领域的新前沿：从CRISPR到下一代技术

《Methods》：Emerging frontiers in genome editing: From CRISPR to next-generation technologies

Saurabh Mishra | Samrah Rehan | Ahmad Mujtaba Barekzai | Ambika Sharma | Alok Raghav

印度坎普尔CSJM大学生命科学与生物技术学院

摘要

基因组编辑技术彻底改变了分子生物学。它能够对多种生物体的遗传物质进行精确修改。本文概述了基因组编辑技术的发展历程，从同源重组技术到目前主导该领域的高级CRISPR-9系统。早期的方法，如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs），为位点特异性DNA切割奠定了基础。然而，这些方法受到复杂性和成本的限制。CRISPR-Cas系统的出现，尤其是CRISPR-Cas9，由于其简单性、高效性和适应性，彻底改变了这一领域。CRISPR-Cas12a、碱基编辑器和Prime编辑器等变体提高了编辑精度，实现了单核苷酸修饰和靶向插入而不产生双链断裂。新兴工具如CRISPR相关转座酶、重组酶融合体和RNA靶向Cas13酶，将操作范围扩展到了RNA。同时，表观基因组编辑和基因驱动技术为治疗和生态学应用带来了新的可能性。高效的递送系统（包括病毒性递送系统如腺相关病毒（AAV）、慢病毒和腺病毒，以及非病毒性递送系统如脂质纳米颗粒、金纳米颗粒、DNA纳米钳）对于临床应用至关重要。未来的发展方向包括人工智能引导的设计、基于逆转录元件的整合以及新型仿生递送载体，以克服当前存在的效率和安全性障碍。这些创新有助于推动基因组编辑技术向精确、可编程和伦理负责的方向发展。尽管仍存在脱靶效应、免疫原性和生殖系伦理问题等未解决的问题，基因组编辑正在重新定义生物医学研究、药物开发和疾病矫正。基于CRISPR的技术现已成为下一代遗传医学的前沿。

引言

在细胞和生物体中对基因组DNA进行直接且精确的工程改造，对基础生物学、医学和生物技术研究产生了重大影响。随着有效基因组编辑技术的引入，研究范式发生了转变，不再仅仅局限于识别和理解遗传疾病，而是积极寻找其根本原因。由于我们对疾病遗传基础的理解不断深入，我们现在能够更好地掌握疾病机制和潜在的治疗方法。然而，尽管在药物开发方面付出了巨大努力，并提出了许多有前景的治疗假设，但使用小分子治疗具有显著遗传因素的疾病仍然非常有限。由于单基因疾病以及受遗传因素强烈影响的疾病（如血友病、严重联合免疫缺陷症（SCID）和特定酶缺乏症）具有独特的遗传组成且缺乏安全有效的替代疗法，因此可能需要新的治疗方法来改变患病细胞和组织中的核酸。早期的基因改造或编辑尝试由于成功率低且容易发生随机插入而受到限制。然而，随着可编程核酸酶的发展，这一领域经历了革命性的变革，这些核酸酶能够精确、准确地靶向DNA序列。得益于这些技术，包括癌症、遗传性疾病、传染病等多种人类疾病现在得到了不同的治疗方法[1]。这些技术影响了药物发现、诊断、我们对基因活性的基本理解以及治疗方法。

通过基因组编辑，以前无法治愈的疾病有可能得到治疗。通过一次性修复相关细胞中的缺陷基因，基因组编辑可以治疗由单一基因缺陷引起的单基因疾病，如镰状细胞贫血或囊性纤维化。基因组编辑还可以治疗各种复杂的多因素疾病和遗传问题。它在肿瘤学中也被广泛应用，用于制造更具抵抗力和杀伤力的免疫细胞，可用于癌症免疫疗法。此外，还在开发从宿主基因组中去除病毒DNA或修改宿主成分以赋予抗性的策略，以应对HIV等传染病[2]。

本文分析了基因组编辑技术的发展历程。从最早的基因靶向技术到突破性的CRISPR-Cas系统，我们将首先概述基因组编辑技术的历史发展。接下来将介绍主要编辑平台的机制、递送策略、优势及缺点，包括CRISPR-Cas9及其更复杂的变体（如碱基编辑和Prime编辑）以及其他尖端技术。

章节摘录

早期的基因靶向技术（同源重组）

基因靶向技术的起源可以追溯到同源重组（HR）的发现，这是一种天然的、高保真的DNA修复机制。同源重组主要发生在细胞周期的S期和G2期，利用同源序列（姐妹染色单体或外源供体模板）作为引导来修复DNA双链断裂（DSBs）[3]。在早期基因组工程中，研究人员通过引入含有同源臂的外源DNA构建体来实现基因靶向。

CRISPR-Cas9（基于双链断裂）

为了获得对噬菌体感染和质粒转移的抵抗力，许多细菌和大多数古菌发展出了由CRISPR位点和相应的CRISPR相关（Cas）基因编码的复杂RNA引导的适应性免疫系统[12]。在接种来自噬菌体或质粒的侵入性遗传元件后，短的外源DNA片段被整合为新的间隔序列，从而形成对先前感染的遗传记忆，使细菌能够识别并抵抗这些入侵者。

转座酶和重组酶

实现靶向DNA插入的通用方法的发展一直是基因组编辑中的一个主要挑战。尽管核酸酶介导的同源重组（HDR）具有高效性，但它依赖于活跃分裂的细胞，这是一个主要缺点。最近，天然存在的CRISPR相关转座酶和合成的Cas-转座酶融合体使得在细菌中的靶向整合成为可能[38]。尽管在哺乳动物细胞中的效果有限且存在显著的目标序列限制，但这类技术仍具有潜力。

基因驱动

基因驱动是一种能够促进自身在种群中快速传播的遗传系统，即使这种传播并不带来生存优势。基于CRISPR的基因驱动系统编码Cas9蛋白和导向同源染色体的引导RNA。当基因驱动系统与野生型生物体交配时，Cas9/sgRNA会切割野生型等位基因。随后，该系统会被细胞转移到另一个染色体上，从而实现基因的修复。

表观基因组编辑

引入不可逆的遗传变化会带来风险，例如意外突变，并引发关于可遗传基因组修饰的伦理问题。CRISPR驱动的表观基因组编辑可以在不影响生殖系DNA的情况下，在多个细胞世代中持续引入特定的表观遗传变化，这是一种有前景的替代方法。通过重新排列特定基因组位点的染色质，可以刺激或抑制目标基因的表达。

基因组编辑的递送策略

在过去十年中，人们提出了许多新的策略和技术，以解决现有CRISPR方法存在的问题，从而提高了CRISPR基因组编辑的性能并扩展了其应用范围。随着递送方式的进步，新的基因组编辑技术也在不断开发中，这些进步为临床应用带来了重大挑战。

人工智能

基因组编辑领域也受到了生物学界近期快速采用深度学习和人工智能（AI）的显著影响。能够预测编辑结果和检测脱靶活动的工具显著提高了基因编辑的精确度和成功率。这些因素对于减少不必要的遗传改变至关重要，尤其是在需要高安全性和治疗效果的临床应用中[87]。未来，基因编辑技术将与人工智能进一步结合，推动该领域的发展。

临床转化的关键瓶颈

有三个主要挑战阻碍了基因组编辑从实验室向临床应用的转化。首先，免疫原性是一个重大障碍。由于自然暴露于S. pyogenes，大多数人已经对其Cas9具有先天免疫力，这可能会引发炎症反应或阻碍治疗过程中的基因修复。此外，无论是病毒性还是合成性的递送载体，往往都会引发先天免疫反应。

结论

在过去十年中，基因组编辑已经从一个小型科学项目发展成为一项重要的生物技术。总体而言，第二代技术（如碱基编辑和Prime编辑）被认为更安全、更准确，因为它们直接修改目标DNA，而不需要诱导双链断裂。相比之下，第一代CRISPR系统主要依赖于制造小的、有意的DNA断裂，并依赖细胞的自然修复机制。

资金支持

本研究没有资金来源。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。