《Poultry Science》：DNA Methylation Profiling of the Granulosa Layer Reveals Epigenetic Features of Excessive Hierarchical Follicle Development in Chickens
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过度层级卵泡（EHF）性状是家禽卵巢功能障碍的一种形式，其特征为层级卵泡的累积，然而该性状背后的发育动态及表观遗传机制尚未被完全阐明。在本研究中，研究人员应用超声检查法监测了鸡的卵泡发育动态。此外，研究人员进行了全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），以识别与 E
过度层级卵泡（EHF）性状是家禽卵巢功能障碍的一种形式，其特征为层级卵泡的累积，然而该性状背后的发育动态及表观遗传机制尚未被完全阐明。在本研究中，研究人员应用超声检查法监测了鸡的卵泡发育动态。此外，研究人员进行了全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），以识别与 EHF 性状相关的颗粒层 DNA 甲基化改变。在产蛋早期，EHF 性状表现出波动性下降趋势，并与产蛋量受损相关。DNA 甲基化主要发生在 CG 背景下，并呈现出启动子低甲基化和基因体高甲基化的模式。在 EHF 鸡的小黄卵泡颗粒层（SYG）中，检测到 CpG 岛、启动子、5′非翻译区（5′UTRs）和外显子区域存在更显著的低甲基化现象。多个与启动子相关差异甲基化区域（DMRs）重叠的基因显著富集于 Wnt 信号通路、钙信号通路和黏着斑通路。在这些基因中，AKT1、PIK3CA、FZD2、CAMK2A 和 RYR2 表现出显著的启动子低甲基化以及 mRNA 表达量的增加。综上所述，该研究表明 SYG 中特定区域的启动子低甲基化可能促进了 EHF 的发育。这些发现增强了对 EHF 性状的表观遗传调控的理解，并可能为产蛋管理提供支持。
**鸡过度层级卵泡发育的表观遗传机制解析**
过度层级卵泡（Excessive Hierarchical Follicles, EHF）性状是家禽养殖中常见的一种卵巢功能紊乱现象，表现为层级卵泡数量异常累积，常伴随产蛋性能下降、蛋品质降低及繁殖力受损。尽管先前的研究已指出 EHF 可能与能量摄入过剩、基因突变或下丘脑 - 垂体 - 卵巢轴紊乱有关，但其具体的发育动态特征及深层的表观遗传调控机制，特别是 DNA 甲基化在其中的作用，尚缺乏系统性认知。鉴于此，研究人员利用文昌鸡模型，结合活体超声监测与全基因组甲基化测序技术，深入探讨了 EHF 性状的发育轨迹及其在颗粒层细胞中的表观遗传修饰特征，旨在揭示其分子调控网络，为家禽遗传改良提供理论依据。该研究成果发表于《Poultry Science》。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，利用多普勒超声系统对产蛋早期（22 周龄起 4 周内）的文昌鸡进行连续活体监测，根据层级卵泡数量将鸡群划分为 EHF 组（≥8 个）和正常层级卵泡（NHF）组（5-6 个）；其次，采集小黄卵泡（SYF）和优势卵泡（DF）的颗粒层组织，提取基因组 DNA 进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），构建高精度甲基化图谱；随后，通过生物信息学分析识别差异甲基化区域（DMRs）及差异甲基化基因（DMGs），并结合基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析挖掘关键通路；最后，利用亚硫酸氢盐测序 PCR（BSP）和定量实时 PCR（qPCR）技术，对候选关键基因的甲基化状态及 mRNA 表达水平进行验证。
研究结果主要包含以下几个方面：
**EHF 性状的发育动态及其对产蛋的影响**
通过超声监测发现，EHF 性状在产蛋早期呈现波动性下降趋势，但始终维持在生理范围之上。EHF 鸡群占总群体的 17%，其卵巢重量、体重及体重指数（BMI）均显著高于 NHF 组。重要的是，EHF 性状与产蛋量显著负相关，随着层级卵泡数量的增加，产蛋率呈下降趋势，证实了该性状对生产性能的负面影响。
**颗粒层 DNA 甲基化图谱特征**
全基因组甲基化分析显示，鸡颗粒层的 DNA 甲基化主要发生在 CG 背景下，且呈现出典型的“启动子低甲基化、基因体高甲基化”的分布模式。虽然全局甲基化水平在 EHF 与 NHF 组间无显著差异，但在小黄卵泡颗粒层（SYG）中，EHF 组在 CpG 岛、启动子、5′UTR 及外显子区域表现出显著的低甲基化特征，而在优势卵泡颗粒层（DG）中未观察到此种显著差异，提示 SYG 是 EHF 表观遗传调控的关键窗口期。
**候选差异甲基化基因及其功能富集**
功能富集分析表明，启动子低甲基化的差异甲基化基因主要富集于 Wnt 信号通路、钙信号通路和黏着斑通路。研究人员进一步筛选出 5 个关键候选基因：AKT1、PIK3CA、FZD2、CAMK2A 和 RYR2。验证实验显示，与 NHF 组相比，EHF 组 SYG 中这 5 个基因的启动子区域甲基化水平显著降低，同时其 mRNA 表达量显著上调。转录因子结合位点预测提示，这种低甲基化可能影响了 SP1、GR 等转录因子的结合，从而促进了基因转录。
讨论部分总结指出，启动子区域的低甲基化通常与染色质开放状态及转录激活相关。本研究中观察到的 SYG 特异性启动子低甲基化可能破坏了正常的卵泡选择机制，导致多个卵泡同时发育而非单一优势卵泡形成，进而引发 EHF。这一发现与人类多囊卵巢综合征（PCO）中观察到的颗粒细胞全基因组启动子低甲基化现象具有相似性，暗示两者可能存在共通的表观遗传病理基础。
研究结论表明，该研究系统刻画了鸡 EHF 性状的发育特征及 DNA 甲基化模式。EHF 性状在观察期内呈波动下降并伴随产蛋减少。其核心表观遗传特征为小黄卵泡颗粒层中精细尺度的启动子低甲基化。特别是富集于 Wnt、钙信号及黏着斑通路的 AKT1、PIK3CA、FZD2、CAMK2A 和 RYR2 基因，表现出显著的启动子低甲基化与表达上调，证实了 DNA 甲基化在 EHF 发生发展中的关键作用。这些发现为理解家禽 EHF 的表观遗传调控机制提供了新视角，并为未来制定针对性的干预策略及繁殖性状改良提供了科学参考。
