《Synthetic and Systems Biotechnology》：Development and clinical validation of a multiplex visual POCT platform based on RT-RAA-CRISPR/Cas12a for porcine diarrheal viruses
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研究人员开发了一种多重逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）-CRISPR/Cas12a检测方法，用于猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪A群轮状病毒（PoRVA）及猪塞佩洛病毒（PSV）的可视化即时检测（POCT）。该方法对三种目标病毒表现出高度特异性，与非靶标猪
研究人员开发了一种多重逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）-CRISPR/Cas12a检测方法，用于猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪A群轮状病毒（PoRVA）及猪塞佩洛病毒（PSV）的可视化即时检测（POCT）。该方法对三种目标病毒表现出高度特异性，与非靶标猪病原体无交叉反应。在优化条件下，系统达到单拷贝级灵敏度，检测限（LOD）分别为5.2拷贝/μL（PEDV）、5.9拷贝/μL（PoRVA）和0.57拷贝/μL（PSV），重复性优异（变异系数<10%）。使用20份临床粪便拭子样本及便携式检测工具箱验证，结果显示与标准逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的一致性达95%-100%。整个“样本到结果”流程可在55分钟内完成，为猪群混合病毒感染的现场快速诊断提供了高效、易用的工具。
本研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，针对猪腹泻病毒混合感染难以快速区分、现有实验室检测方法依赖昂贵仪器且耗时长的问题，研究人员开发了基于逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与CRISPR/Cas12a系统的多重可视化即时检测（POCT）平台，用于同时检测PEDV、PoRVA和PSV。研究结果表明，该平台兼具高灵敏度与高特异性，可在55分钟内完成从样本处理到结果判读的全过程，并在临床样本中验证了与标准方法的高度一致性，为猪场现场监测与疫病防控提供了可靠技术支撑。
关键技术方法包括：在保守基因区域设计RT-RAA引物与crRNA，结合CRISPR/Cas12a的顺式和反式切割活性实现信号放大；采用正交试验优化Cas12a、crRNA及ssDNA报告探针浓度，确立最佳反应温度与时间；构建单重、双重及三重反应体系，通过调整引物比例克服多重扩增中的竞争效应；使用重组质粒评估检测限（LOD）与特异性，并在临床粪便拭子样本中验证检测性能。
1. 单重RT-RAA-CRISPR/Cas12a系统的可行性验证
研究人员首先验证了CRISPR/Cas12a系统的组件依赖性，确认只有当Cas12a、crRNA、ssDNA报告探针及靶标模板同时存在时才能产生荧光信号；凝胶电泳显示crRNA能有效引导Cas12a切割靶标序列；引入RT-RAA预扩增后，荧光强度显著提升，证实该策略可实现高灵敏可视化检测。
2. RAA引物与crRNA的筛选
通过对多个候选引物的扩增效率比较，选出PEDV-F1/R1、PoRVA-F2/R2、PSV-F2/R2组合；进一步筛选对应crRNA，确定PEDV-crRNA1、PoRVA-crRNA2与PSV-crRNA2为最优组合，用于后续实验。
3. 单重系统反应条件优化
以PEDV质粒为模型，正交试验确定75 nM Cas12a与200 nM crRNA为最佳浓度，ssDNA报告探针最佳浓度为3 μM；反应在37℃孵育30分钟可获得最高荧光信号，确定为标准检测条件。
4. 多重检测体系的建立与优化
研究人员在总引物浓度5 μM条件下，调整各靶标引物比例为2.5:1:0.5（PEDV:PoRVA:PSV），解决了多重扩增中PEDV信号偏弱的问题；优化反应温度为37℃，时间为25分钟，确保低载量靶标的稳定检出。
5. 分析性能评估
灵敏度测试表明LOD分别为10?拷贝/μL（PEDV、PoRVA）和10?1拷贝/μL（PSV），线性相关性良好；特异性实验显示仅靶标病毒产生信号，非靶标病原体无交叉反应；重复实验中批内与批间变异系数分别低于5%与10%；荧光信号在室温避光保存6天仍保持稳定。
6. 临床样本验证
在20份临床粪便拭子样本中，该方法与RT-PCR和RT-qPCR的检测一致性分别为PEDV 100%、PoRVA 100%、PSV 95%，阴性对照无信号，证明其在真实场景中的可靠性。
在讨论部分，研究人员指出该平台结合了RT-RAA的等温扩增优势与CRISPR/Cas12a的双重特异性识别机制，克服了单一等温扩增易受非特异性产物干扰的问题，并将检测灵敏度提升至接近RT-qPCR水平。PSV灵敏度更高的原因可能与其扩增子较短及crRNA结合效率更高有关。与依赖昂贵热循环仪的方法相比，该系统仅需37℃恒温设备即可运行，且无需复杂纳米材料标记，显著降低了检测成本。未来可通过人工PAM序列或工程化Cas蛋白拓展靶点选择范围，并探索单管封闭系统以减少气溶胶污染风险。
结论
本研究成功建立了基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a的多重核酸可视化检测平台，可在55分钟内完成PEDV、PoRVA及PSV的同时检测，具有高灵敏度、高特异性及良好的临床一致性。配套便携式检测工具箱进一步提升了该技术在养猪场的现场应用潜力，为全球生猪产业的疫病早期监测与传播风险控制提供了有力的技术支持。
