《The Veterinary Journal》：PD-L2 reverse signaling suppresses tumor cell proliferation and serves as a prognostic indicator in canine high-grade mast cell tumors
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花井大一|木村龙成|三井一树|宫前次郎|松田昭良|hemmi弘明|村上康平冈山理科大学兽医学院，日本爱媛县今治市伊古井野冈1-3，邮编794-8555摘要肥大细胞肿瘤（MCTs）是犬类常见的皮肤肿瘤。这些肿瘤需要通过组织学分级，而高级别MCT的犬只预后较差。犬类MCT会表达程序性
花井大一|木村龙成|三井一树|宫前次郎|松田昭良|hemmi弘明|村上康平
冈山理科大学兽医学院，日本爱媛县今治市伊古井野冈1-3，邮编794-8555
摘要
肥大细胞肿瘤（MCTs）是犬类常见的皮肤肿瘤。这些肿瘤需要通过组织学分级，而高级别MCT的犬只预后较差。犬类MCT会表达程序性细胞死亡-1配体2（PD-L2）的mRNA，该物质可调节T细胞活性，并作为多种人类肿瘤的预后指标。我们假设PD-L2有助于免疫逃逸并影响犬类MCT的预后。通过对38例犬类MCT（包括15例Kiupel低级别和23例高级别病例）进行免疫组化检测，评估了PD-L2的表达情况。PD-L2主要存在于肿瘤细胞表面，在低级别MCT中，大多数细胞（PD-L2阳性肿瘤细胞的中位比例：83.5%）都表达了PD-L2。相比之下，高级别MCT中的PD-L2表达具有高度变异性（中位数：25.5%），PD-L2阳性肿瘤细胞较少的病例预后更差（中位生存时间：148天对比468天）。这一意外结果促使我们提出了一个新的假设：肿瘤细胞上的PD-L2通过接收反向信号来抑制肿瘤细胞的活性。与此一致的是，RNA测序显示，在腺病毒介导的PD-L2基因转移及随后可溶性PD-1暴露后，犬类MCT细胞系BR中的70个基因表达发生了改变。此外，PD-1-PD-L2反向信号传导抑制了PD-L2表达的BR细胞的增殖。总体而言，我们的发现证明了PD-L2表达在高级别MCT犬只中的预后意义，并表明PD-L2阳性肿瘤细胞的增殖可能受到PD-L2反向信号传导的调控。
引言
皮肤肥大细胞肿瘤（MCTs）是犬类最常见的皮肤肿瘤，占所有皮肤肿瘤的21%（Welle等人，2008年）。MCT的临床表现各不相同，从良性到高度侵袭性和转移性都有。Kiupel等人（2011年）提出的两级组织学分级系统已被证明有助于预测犬类MCT的临床表现，将其分为预后较差的高级别肿瘤和预后较好的低级别肿瘤。然而，仅凭组织学分级无法预测每个MCT的行为，因此需要额外的预后标志物（Sabattini等人，2015年）。
多种抑制性受体-配体相互作用会减弱免疫反应。程序性细胞死亡-1（PD-1）是T细胞上表达的关键抑制性受体，其有两个已知的配体：程序性细胞死亡-1配体1（PD-L1）和程序性细胞死亡-1配体2（PD-L2）。PD-L1在正常组织和肿瘤中普遍存在（Mittendorf等人，2014年；Azuma等人，2014年），并通过其细胞外结构域与T细胞上的PD-1结合，导致T细胞功能障碍和凋亡。这一过程称为“正向信号传导”（Freeman等人，2000年）。此外，表达PD-L1的细胞还可以通过其细胞质结构域传递信号，这一过程称为“反向信号传导”（Tamburini，2022年）。例如，在癌细胞中，PD-L1反向信号传导可以保护这些细胞免受细胞毒性T细胞和干扰素（IFN）诱导的凋亡（Azuma等人，2008年；Gato-Ca?as等人，2017年；Ghebeh等人，2010年）。在小鼠树突状细胞中，PD-L1反向信号传导促进树突状细胞从皮肤迁移到引流淋巴结（Lucas等人，2020年）。PD-1的第二个配体PD-L2对PD-1的亲和力更强（Zak等人，2017年）。PD-L2主要表达在抗原呈递细胞上（Tseng等人，2001年），并通过正向信号传导抑制T细胞活化（Latchman等人，2001年；Nakayama等人，2020年）。重要的是，与PD-L1不同，PD-L2反向信号传导的存在或功能尚未得到证实。
在我们之前的研究（Murakami等人，2022年）中，我们发现犬类MCT表达了高水平的PDCD1LG2 mRNA（编码PD-L2）。因此，我们假设表达PD-L2的犬类MCT会在肿瘤微环境中抑制T细胞活化，从而导致更差的预后。在这里，我们明确了犬类MCT上的PD-L2表达及其与MCT犬只预后的关联。
章节摘录
伦理声明
为了验证抗PD-L2抗体的有效性，冈山理科大学兽医学院伦理审查委员会批准了肿瘤组织采样的方案（批准编号：2020–0004），并获得了所有犬主人的书面知情同意。由于这项回顾性组织学研究并未使用活体动物来探讨PD-L2表达与预后之间的关联，因此无需机构动物护理和使用委员会的批准。
抗PD-L2抗体的验证
由于市场上没有商用抗犬PD-L2抗体，我们测试了抗人PD-L2抗体（AF1224）与犬PD-L2的交叉反应性。人PD-L2（NP_079515）和犬PD-L2（XP_038511300.1）的全长蛋白氨基酸序列同源性为56.3%。C末端标记有mCherry的犬PD-L2被强制表达在CHO细胞中。共聚焦激光显微镜检测到细胞表面的融合蛋白（补充图S1A），随后进行了免疫印迹实验。
讨论
在过去二十年里，人们为建立精确的预后方法和识别犬类MCT的新治疗靶点做出了大量努力。基于本研究的数据，我们提出了几个观点。
首先，我们提出PD-L2可作为Kiupel高级别MCT犬只的新预后标志物。尽管Kiupel 2级恶性分类被广泛接受并用于预测犬类皮肤MCT的预后，但它存在一些局限性。
结论
本研究表明，通过PD-L2介导的PD-1反向信号传导可以抑制犬类高级别肥大细胞肿瘤的增殖并预测良好的预后。PD-L2介导的信号传导调节基因表达和增殖的现象表明，PD-L2主要通过抑制MCT本身的行为来发挥作用，而不仅仅是作为T细胞的免疫抑制剂。我们的发现为PD-L2阳性肿瘤在犬类和人类中的生物学行为提供了新的见解。
伦理批准
该研究方案获得了冈山理科大学兽医学院的批准（批准编号：2020–0004）。
资金信息
本研究未获得任何公共、商业或非营利部门的特定资助。
花井大一：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、实验设计、数据分析。木村龙成：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、实验设计、数据分析。三井一树：撰写 – 审稿与编辑、数据验证、资源获取、方法学设计、实验设计。宫前次郎：撰写 – 审稿与编辑、监督工作。松田昭良：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、方法学设计。hemmi弘明：撰写 – 审稿与编辑、监督工作。村上康平：撰写 – 初稿撰写。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用Gemini工具对语言和语法进行了优化，随后Steven D. Aird进行了技术编辑。作者们对内容进行了审查和编辑，并对最终发表的文章负全责。
致谢
作者感谢提供临床信息的兽医诊所。本研究中使用了由G. H. Caughey博士（加州大学心血管研究所）提供的BR细胞，以及由松田宏博士和田中茜博士（东京农工大学）提供的MPT-3细胞。作者还感谢Steven D. Aird对手稿的编辑工作。本研究得到了今治市和爱媛县的支持。
