《Microbiology Spectrum》：Development of an indirect ELISA based on a multi-epitope recombinant protein for antibody detection against African swine fever virus
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非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种高度接触性、致死性的猪出血性疾病。尽管越南与菲律宾已批准相关疫苗上市，但其全球推广仍受限于安全性与有效性大规模验证不足，因此快速可靠的检测方法对防控至关重要。研究人员利用免疫信息学工具，从非洲猪
非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种高度接触性、致死性的猪出血性疾病。尽管越南与菲律宾已批准相关疫苗上市，但其全球推广仍受限于安全性与有效性大规模验证不足，因此快速可靠的检测方法对防控至关重要。研究人员利用免疫信息学工具，从非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）四种主要结构蛋白p30、p54、p72及pA104R中预测并筛选出15个保守B细胞表位，理性设计并构建了多表位抗原（multi-epitope antigen, MEA）。该重组蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达后，经Western blot与间接免疫荧光试验验证了免疫活性。以其为包被抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA）并系统优化了反应条件。通过对100份已知ASFV阴性血清的分析，确定最佳临界值为0.315。该方法的批内与批间变异系数均低于10%，重复性优异；与其他常见猪病毒阳性血清无交叉反应，特异性强。灵敏度方面，可检出最高稀释至1:6,400的血清抗体。在临床样本验证中，针对流行基因II型毒株，该方法较两种商品化ELISA试剂盒表现出更高的灵敏度。上述结果表明，研究人员成功开发了高灵敏、高特异的ASFV抗体iELISA检测方法，可为大规模流行病学监测及ASF防控策略实施提供有力工具。
非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种极具破坏性的猪传染病，在全球范围内造成了巨大的经济损失。ASFV是一种复杂的包膜双链DNA病毒，基因组庞大，编码超过150种蛋白，其高度的免疫多样性给疫苗研发和诊断试剂开发带来了巨大挑战。尽管越南和菲律宾等国近期批准了部分疫苗使用，但全球范围内仍缺乏普遍标准化且安全的疫苗，防控工作在很大程度上依然依赖快速准确的诊断技术。目前的血清学检测方法存在灵敏度不稳定的缺陷，容易导致漏检，影响监测计划的有效性。为了解决这一问题，研究人员采用了一种理性的表位工程策略，从ASFV的p30、p54、p72和pA104R四种主要结构蛋白中，通过免疫信息学手段预测并筛选出15个保守且具有免疫优势的B细胞表位，构建了一个单一的多表位抗原（multi-epitope antigen, MEA）。本研究旨在开发一种基于此MEA的高灵敏度、高特异性间接酶联免疫吸附试验（indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA），以提升ASF的血清学检测水平，相关成果发表在《Microbiology Spectrum》。
在关键技术方法上，研究人员首先利用免疫信息学工具对ASFV SY18株的p30、p54和p72蛋白进行B细胞表位预测，并结合已报道的pA104R表位，设计了包含15个表位的多表位抗原序列。通过生物信息学软件对其理化性质、二级结构和三维模型进行了全面的计算机模拟分析。随后，研究人员将优化后的基因序列在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并纯化获得重组MEA蛋白，利用Western blot和间接免疫荧光试验验证其免疫活性。在此基础上，系统优化了iELISA的各项反应参数，并利用已知阴性和阳性血清确定了临界值。最后，研究人员采用临床样本队列，将开发的MEA-iELISA与两种市售商品化ELISA试剂盒进行了比较，并以qRT-PCR结果作为参考标准评估了其诊断性能。
研究结果部分主要分为以下几个板块。在设计与计算机模拟分析部分，研究人员利用Immune Epitope Database (IEDB)和SVMTriP工具预测了表位，最终选定15个高分表位，通过“GGGS”柔性连接肽和“KK”刚性连接肽串联构建MEA。计算机模拟显示MEA具有较高的抗原性预测值（ANTIGENpro预测概率0.94），无致敏性，理论等电点（pI）为9.69，不稳定指数为33.55，属于稳定蛋白，且可溶性预测评分0.601表明其为可溶性表达。结构分析显示其含有约52%的无规则卷曲，有利于表位暴露。在MEA的表达、纯化与免疫反应性部分，研究人员在大肠杆菌中成功表达了约50 kDa的重组蛋白，并通过Ni-NTA亲和层析纯化。Western blot结果显示，该蛋白能被抗His标签单抗及p30、p54、p72多克隆抗体、pA104R单克隆抗体和ASFV感染猪混合血清特异性识别。间接免疫荧光试验进一步证实其在真核系统中表达的天然构象具有良好的免疫反应性。在基于MEA的间接ELISA优化部分，通过棋盘滴定法确定了最佳抗原包被浓度为200 ng/孔，血清最佳稀释度为1:200，并优化了包被液、封闭液、孵育时间及显色条件。在确定临界值、特异性、灵敏度及重复性部分，基于100份阴性血清确定的临界值为0.315（OD630）。灵敏度测试显示最低检测稀释度可达1:6,400。特异性测试显示与猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis, GPS）阳性血清均无交叉反应。重复性测试中，批内和批间变异系数（CV）均显著低于10%。在临床样本诊断性能部分，对140份临床血清的检测显示，MEA-iELISA的阳性检出率为48.57%（68/140），高于INGENASA试剂盒的44.29%（62/140）和科前生物试剂盒的41.43%（58/140）。在45份结果不一致的样本中，经qRT-PCR确诊的31份阳性样本中，MEA-iELISA正确检出25份，优于对照试剂盒，显示出更高的诊断灵敏度，尤其在感染早期阶段优势明显。
讨论部分指出，目前ELISA的性能主要取决于包被抗原的设计。传统的全长蛋白或多蛋白组合虽然能提高灵敏度，但面临生产成本高、批次差异大及包被比例难优化等问题。本研究采用的单一嵌合多表位抗原策略不仅简化了生产流程，降低了成本，还实现了关键表位的精准排列。预测的表位与已发表的实验验证表位具有高度一致性，证明了免疫信息学工具的可靠性。大肠杆菌表达系统避免了真核表达可能带来的糖基化导致的表位遮蔽，确保了B细胞表位的充分暴露。MEA设计中高比例的无规则卷曲增强了表位的表面可及性，这可能是其表现出优异检测性能的结构基础。与商业试剂盒相比，MEA-iELISA因融合了多个关键表位，克服了单一p72抗原或全蛋白可能产生的空间位阻或表位遮蔽问题，从而在早期感染检测中表现更佳。研究人员同时指出，尽管所选表位考虑了基因型间的保守性，但该方法的广谱性仍需在更多基因型毒株中进行验证。
结论部分翻译如下：本研究成功采用一种理性的、基于免疫信息学的策略，设计、表达并验证了一种新型多表位重组抗原MEA，其包含了ASFV四种主要结构蛋白的关键B细胞表位。以此MEA作为包被抗原建立的iELISA，在检测猪血清中的ASFV抗体时表现出高灵敏度、高特异性和良好的重复性。值得注意的是，临床样本的对比评估显示，MEA-iELISA的诊断灵敏度优于市售试剂盒，特别是在检测早期感染方面。总之，本研究确立的MEA-iELISA是一种高效且潜在低成本的临床诊断和大规模血清学监测工具，其应用将极大地助力全球ASF的持续防控与根除工作。
