孕烷X受体在人醛氧化酶基因表达上调中的作用

《Biochemical Pharmacology》：Role of pregnane X receptor in the upregulation of human aldehyde oxidase gene expression

本研究旨在验证孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)调控人醛氧化酶(human aldehyde oxidase, AOX1)基因表达的假说。研究人员使用LS180人结肠腺癌细胞（常用的人PXR实验模型）进行处理，给予多种人PXR激动剂（利福平、T0901317、SR12813、利托那韦或紫杉醇）后，AOX1 mRNA表达分别升高5.2倍、10.2倍、4.7倍、2.2倍和6.5倍，同时典型人PXR靶基因CYP3A4 mRNA表达分别升高9.5倍、13.5倍、7.2倍、3.4倍和18.0倍；在上述人PXR激动剂处理组中，AOX1与CYP3A4 mRNA水平升高的相关系数达0.83。利福平引起的AOX1 mRNA表达升高伴随AOX1蛋白表达增加，且该效应可被放线菌素D阻断，表明其通过转录机制实现。此外，人PXR药理拮抗（SPA70）、人PXR基因敲降（siRNA）及人PXR异二聚体伴侣视黄酸X受体(retinoid X receptor, RXR)的药理拮抗（HX531）均可减弱利福平诱导的AOX1 mRNA升高。在原代培养人肝细胞中，利福平可诱导AOX1（mRNA及催化活性）及其他人PXR靶基因（CYP3A5、UGT1A1、UGT1A3和ABCB1）。体内实验中，对C57BL/6小鼠给予小鼠PXR激动剂孕烯醇酮16α-腈(pregnenolone 16α-carbonitrile, PCN)，可升高肝脏胞质Aox1 mRNA表达及Aox介导的酶活性（carbazeran 4-氧化和O6-苄基鸟嘌呤8-氧化）；对照分析显示PCN可升高小鼠PXR调控的Cyp3a11 mRNA及Cyp3a介导的酶活性。综上，本研究首次证实PXR参与AOX1基因表达调控。

该研究发表于《Biochemical Pharmacology》，针对人醛氧化酶(human aldehyde oxidase, AOX1)这一重要的I相胞质药物代谢酶的调控机制展开探索。当前已知AOX1可催化多种药物的氧化、还原和水解反应，其抑制剂已被广泛鉴定，但关于AOX1的诱导机制研究十分有限。孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)作为核受体超家族成员，可调控大量药物代谢酶与转运体的表达，但此前尚未明确其是否参与AOX1的表达调控。由于AOX1的底物药物（如idelalisib、flutamide）的临床药代动力学易受代谢酶诱导的影响，阐明其调控机制对预测临床药物-药物相互作用具有重要意义，因此研究人员设计了本项研究以验证PXR调控AOX1表达的核心假说。

研究人员采用了细胞水平、原代肝细胞及动物水平的多层次研究体系。实验所用细胞模型为经STR鉴定的LS180人结肠腺癌细胞与Hepa1-6小鼠肝癌细胞；原代培养人肝细胞来自商业化冻存样本（供体编号HUM4021、HUM191651、HUM183121、HUM190131），采用三明治培养模型；动物实验选用7~9周龄雄性C57BL/6小鼠，经腹腔注射给予小鼠PXR激动剂孕烯醇酮16α-腈(pregnenolone 16α-carbonitrile, PCN)。关键技术方法包括：实时荧光定量PCR检测基因表达、UHPLC-MS/MS靶向蛋白质组学定量AOX1蛋白、LDH释放法评估细胞毒性、siRNA基因敲降技术、药理拮抗实验及AOX介导的特异性酶活性测定（carbazeran 4-氧化和O⁶-苄基鸟嘌呤8-氧化）。

研究结果如下：

1. 1.
   人PXR激动剂升高LS180细胞中AOX1与CYP3A4 mRNA表达。在10 μM浓度处理96小时的无明显细胞毒性条件下，利福平、T0901317、SR12813、利托那韦、紫杉醇均显著升高AOX1与CYP3A4 mRNA水平，二者升高倍数呈正相关（r=0.83, P<0.05）。
2. 2.
   人PXR激动剂对AOX1 mRNA的诱导具有时间与浓度依赖性。10 μM利福平处理72~120小时达到平台期，最大诱导倍数约7倍；浓度-效应关系显示最小有效浓度为10 μM，EC₅₀为17 μM，E_max为7倍升高。
3. 3.
   人PXR激动剂升高LS180细胞中AOX1蛋白表达。经60 μM利福平处理96小时后，LS180细胞胞质中AOX1蛋白水平从23±5 fmol/mg升高至75±9 fmol/mg。
4. 4.
   人PXR激动剂升高原代培养人肝细胞中AOX1 mRNA表达与催化活性。利福平可诱导不同供体来源的原代肝细胞AOX1 mRNA表达，并升高其carbazeran 4-氧化与O⁶-苄基鸟嘌呤8-氧化活性，该效应伴随经典PXR靶基因（CYP3A4、CYP3A5、UGT1A1、UGT1A3、ABCB1）的同步诱导。
5. 5.
   人PXR激动剂通过转录机制上调AOX1表达。预先给予RNA合成抑制剂放线菌素D可完全阻断利福平对AOX1与CYP3A4 mRNA的诱导作用。
6. 6.
   人PXR药理拮抗或基因敲降减弱AOX1的诱导效应。选择性人PXR拮抗剂SPA70可分别减弱利福平诱导的AOX1与CYP3A4 mRNA升高的50%与67%；靶向人PXR的siRNA敲降可显著降低利福平的诱导幅度。
7. 7.
   人PXR异二聚体伴侣RXR的药理拮抗减弱AOX1的诱导效应。RXR拮抗剂HX531在不影响基础表达的前提下，可显著抑制利福平对AOX1与CYP3A4的诱导作用。
8. 8.
   体内给予小鼠PXR激动剂升高小鼠肝脏Aox1 mRNA与酶活性。PCN处理可使小鼠肝脏Aox1 mRNA升高，同时升高carbazeran 4-氧化与O⁶-苄基鸟嘌呤8-氧化活性，而Aox3 mRNA表达被下调，对照指标Cyp3a11 mRNA与睾酮6β-羟化酶活性同步升高。

讨论部分指出，本研究首次证实核受体PXR是AOX1的正向调控因子，其调控强度与CYP3A5、UGT1A1等靶基因相当，弱于CYP3A4。这种差异可能与PXR-RXR异二聚体在AOX1启动子的结合效率或辅阻遏物的募集有关。利托那韦诱导效应较弱可能与其自身作为底物被代谢及外排导致细胞内暴露量降低相关。基于临床给药剂量下的游离药物浓度计算，利福平在体内具有诱导AOX1的潜力，可能增加AOX1底物药物的清除。小鼠Aox1与人AOX1的调控模式无物种差异，且PCN对Aox3的抑制作用提示不同Aox亚型受独立调控。研究结论明确，PXR通过转录机制调控AOX1表达，为临床PXR激动剂与AOX1底物药物联用时的相互作用预测提供了分子基础。