《Biomaterials》：Dual-Functional Poly(disulfide) Enables "Once-and-for-all" Atherosclerosis Therapy via Precision Hepatocyte Base Editing
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张晓萍|高世娟|陈丹阳|王红英|左敏赞|王乐勇|张庆文|王瑞兵中国医学科学院中药研究所中医药机制与质量国家重点实验室，以及澳门大学精准肿瘤学前沿科学中心，中国澳门特别行政区塔ipa，999078摘要基于CRISPR的碱基编辑器在遗传医学领域具有变革潜力，但其临床应用受到细胞特异性
张晓萍|高世娟|陈丹阳|王红英|左敏赞|王乐勇|张庆文|王瑞兵
中国医学科学院中药研究所中医药机制与质量国家重点实验室，以及澳门大学精准肿瘤学前沿科学中心，中国澳门特别行政区塔ipa，999078
摘要
基于CRISPR的碱基编辑器在遗传医学领域具有变革潜力，但其临床应用受到细胞特异性递送、高效胞质释放和持久活性的限制。在这里，我们报道了一种双功能聚（二硫键）聚合物，它能够同时实现肝细胞特异性靶向和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）的直接胞质递送。通过展示半乳糖配体与肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体（ASGPRs）结合，我们的聚合物能够特异性识别肝细胞。关键的是，聚（二硫键）骨架通过硫醇-二硫键交换促进直接胞质递送，绕过了内体捕获。这种双功能系统能够高效地将ABEs递送到肝细胞中，从而在单次给药后实现对ANGPTL-3基因的持久编辑。在动脉粥样硬化的小鼠模型中，这种单次治疗显著降低了低密度脂蛋白胆固醇水平，并显著减少了斑块形成。据我们所知，这是首次成功应用碱基编辑技术通过单次剂量有效预防和治疗动脉粥样硬化。我们的工作为动脉粥样硬化及其他代谢性疾病的精准基因组医学建立了一个“一次性的”治疗平台。
引言
动脉粥样硬化是全球动脉粥样硬化性心血管疾病流行的主要病理驱动因素，通过冠状动脉疾病和急性冠状动脉综合征导致大量发病率和死亡率[1]。血脂异常被广泛认为是动脉粥样硬化发病机制中的主要可改变风险因素[2]，其中升高的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）——约占循环中的致动脉粥样硬化脂蛋白的75%——既是斑块形成的起始因素，也是其持续发展的原因[3, 4]。尽管他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶仍是治疗的基石，但其临床效果受到患者反应不佳（15-20%）和耐受性问题限制，使得大量患者仍然容易受到持续的血管损伤[5, 6]。这一持续的治疗缺口凸显了迫切需要创新策略，以提供更强大和持久的LDL-C降低效果，克服慢性药物干预的局限性。
最近的进展确定了PCSK9和ANGPTL-3作为脂质调节的关键但不同的靶点[7]。PCSK9抑制剂——包括单克隆抗体、siRNA和反义寡核苷酸——通过增强LDL受体回收来降低LDL-C。然而，它们存在频繁给药、高成本以及在LDLR缺乏人群中效果降低等局限性[8, 9]。相比之下，ANGPTL-3是一种由肝细胞分泌的脂蛋白脂肪酶和内皮脂肪酶调节因子，通过非LDLR依赖机制调节LDL-C和甘油三酯代谢，提供了独特的治疗优势[10]。人类遗传学研究表明，ANGPTL-3的功能丧失变异体能够提供持久的心脏保护作用，且没有明显的不良反应，使其成为一种理想的持久干预靶点[11]。然而，目前的ANGPTL-3靶向生物制剂仅产生短暂效果，需要重复给药。例如，Solbinsiran是一种药物RNA沉默策略，可暂时抑制ANGPTL3 mRNA。其在PROLONG-ANG3二期试验中的临床方案涉及在0天和90天时进行两次皮下注射。这突显了迫切需要新的治疗策略，能够通过持久的基因编辑实现持续的ANGPTL-3抑制，特别是对于治疗抵抗的患者群体。
CRISPR-Cas9革命开启了精准基因组编辑的新时代。在其工具中，碱基编辑器因其在治疗应用中的潜力而脱颖而出[12, 13, 14]，腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）能够在不引起双链断裂的情况下实现精确的A•T到G•C转换。这克服了传统CRISPR系统依赖易出错修复途径的关键限制[15]。ABEs在纠正致病单核苷酸多态性方面具有前所未有的准确性，同时最小化了脱靶效应，使其特别适用于治疗代谢性和心血管疾病[16]。与传统需要长期给药的治疗方法不同，ABEs承诺通过单次干预实现持久甚至可能治愈的效果。然而，其临床应用取决于解决递送挑战——特别是需要安全、高效的系统来实现靶向组织分布。
基于CRISPR的治疗药物的临床应用仍受到基本递送挑战的阻碍。虽然脂质纳米颗粒（LNPs）在mRNA疫苗中取得了成功，但它们在基因编辑中的应用面临重大限制，包括内体逃逸效率低（导致载荷递送率低于2%）和高免疫原性[17, 18, 19]。这些问题对于需要高递送效率和优异安全性的碱基编辑尤为重要。基于二硫键的递送系统通过独特的硫醇介导的摄取机制提供了一个有前景的替代方案，绕过了内体捕获这一核酸递送的主要瓶颈。聚（二硫键）载体作为一种多功能平台，能够递送多种治疗载荷，并具有良好的生物相容性[20, 21, 22]。然而，要实现治疗性碱基编辑的全部潜力，必须解决三个关键挑战：实现细胞特异性靶向、确保高效胞质释放和维持持久的治疗效果。
在这里，我们开发了一种创新的半乳糖修饰聚（二硫键）递送系统，能够实现肝细胞特异性靶向和ABEs的直接胞质递送，从而实现高效的肝脏限制性碱基编辑。该平台通过双重机制发挥作用：半乳糖配体通过结合唾液酸糖蛋白受体（ASGPRs）介导选择性肝细胞摄取，而富含二硫键的聚合物骨架通过硫醇-二硫键交换实现直接胞质进入，有效绕过了内体捕获。在动脉粥样硬化的预防和治疗小鼠模型中，单次给药实现了高效的ANGPTL-3编辑，显著抑制了疾病进展并产生了持久效果。这比当前疗法（如他汀类药物、siRNA或抗体）有了显著改进，后者需要长期给药并面临患者依从性和长期毒性问题。这项技术为通过靶向、持久的基因组编辑干预代谢性和心血管疾病建立了新的范式，直接解决了传统治疗方案的关键限制。
章节片段
材料
丙烯酰氯、2-羟乙基二硫键、三乙胺、N-Boc-乙二胺、1-氨基吡唑盐酸盐、5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)、甲基-β-环糊精、氯丙嗪盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。mPEG-COOH购自Bide Pharmaceutical Technology Co., Ltd.（中国上海）。半乳糖-PEG-COOH购自Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd.（中国西安）。
使用优化的sgRNAs高效编辑ANGPTL-3的ABE
为了实现ABE系统的有效递送，我们设计了三种针对ANGPTL-3的sgRNAs。这些sgRNAs旨在在特定位置诱导A•T到G•C的转换，可能产生剪接突变。这三种sgRNAs靶向ANGPTL-3的第6外显子（图S1），其序列列在表S2中。每种sgRNA随后被克隆到质粒载体中，并通过Sanger测序确认了成功的构建（图S2）。
为了评估编辑效率，我们共转染了Hepa
讨论
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑已成为治疗遗传疾病的一个变革性平台[28]。最近开发的碱基编辑器，特别是腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），通过实现精确的单核苷酸转换而不引起双链断裂，从而最小化了基因毒性风险[29]。然而，ABEs的临床应用严重依赖于解决递送挑战——实现
结论
总之，我们报告了一种肝细胞靶向的聚（二硫键）胞质递送平台，通过持久的碱基编辑实现了动脉粥样硬化的预防和治疗。通过结合半乳糖介导的肝细胞特异性和硫醇-二硫键交换实现直接胞质递送，该系统能够通过单次给药实现高效和持久的ANGPTL-3碱基编辑。在动脉粥样硬化的预防和治疗小鼠模型中，单次给药
CRediT作者贡献声明
张庆文：研究、数据管理。王瑞兵：写作——审稿与编辑、监督、资源获取、方法学、资金申请、数据管理、概念化。张晓萍：写作——初稿、软件、方法学、研究、数据管理、概念化。高世娟：研究、数据管理。陈丹阳：可视化、研究。王红英：可视化、软件、研究。左敏赞：研究、数据管理。王乐勇：
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了科学和技术发展基金（澳门特别行政区，项目编号：0127/2024/RIA2、0001/2023/RIA1、005/2023/SKL和0008/2025/EQP）、国家自然科学基金（项目编号：T2222013、52233008和52073203）以及南京大学高级学者国际奖学金的财政支持。
