无需扩增的光激活CRISPR/Cas12a系统，配备纳米放大器，用于非核酸目标的定量检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Amplification-free light-activated CRISPR/Cas12a system with nano-amplifier for quantitative detection of non-nucleic acid targets

李佩辉|胡琴琴|李燕|李少华|阮正尚|尹坤|孙桂荣

中国山东省青岛市青岛大学附属医院心脏病科，邮编266000

摘要

无需量化的CRISPR/Cas诊断方法在检测非核酸临床生物标志物时，受到信号转换效率低和灵敏度不足的限制。本文提出了一种光激活的CRISPR/Cas12a生物传感平台（LANA），以应对这一挑战。该平台采用级联信号增强策略，结合了免疫磁富集技术、带有光解激活剂的适配体功能化金纳米颗粒以及紫外光触发的激活剂释放机制，从而启动Cas12a的切割反应。这种光控机制克服了表面限制带来的空间障碍，实现了对信号启动的精确时间控制，并有效抑制了背景激活。以心肌肌钙蛋白I（cTnI）作为模型分析物，LANA的检测限达到50 pg/mL，动态范围为0.05-500 ng/mL，表现出高灵敏度和可靠的定量性能，且检测过程简单，仅需荧光读数即可完成。由于其模块化设计且无需扩增，该平台可轻松应用于其他蛋白质或小分子生物标志物的检测，为非核酸目标的灵敏检测提供了一个通用且无需扩增的框架。

引言

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）酶系统已成为强大的分子诊断工具，因其高特异性、可编程性和等温操作特性而受到重视（Abudayyeh和Gootenberg 2021；Chertow 2018；Kaminski等人2021；Knott和Doudna 2018）。在CRISPR RNA（crRNA）的引导下，Cas效应器（如Cas12、Cas13）能够高保真地识别互补的DNA或RNA。与目标结合后，Cas效应器会表现出旁观核酸酶活性，无差别地切割附近的报告分子，从而将特定的识别事件转化为可检测的信号（Kaminski等人2021）。当与预扩增技术结合使用时，CRISPR/Cas系统可以实现单碱基分辨率的超灵敏检测，例如DETECTR（Chen等人2018）和SHERLOCK（De Puig等人2021）平台用于核酸分析。

CRISPR/Cas技术的最新进展使其应用范围扩展到了非核酸分析物（Duan等人2023；Zhang等人2025），包括蛋白质（Samanta等人2022）、小分子（Chen等人2024a）和金属离子（Yu等人2024）。鉴于这些分子在生理过程中的关键调控作用（Boeve等人2022；Liu和Wang 2024），它们的失调成为诊断（Cui等人2021）、治疗监测（Zhou等人2024）和预后评估（Hoiland等人2022）的重要生物标志物。这一扩展的关键在于信号转导策略，其中分子识别元件（如与核酸结合的抗体（Xu等人2025）、适配体（Han等人2024）、DNA酶（Shi等人2024）和结构切换探针（Song等人2025；Su等人2025）将非核酸目标的结合转化为核酸触发剂的释放或激活。这些触发剂随后刺激CRISPR/Cas系统产生间接检测信号。

尽管取得了这些进展，但非核酸目标的准确量化仍然具有挑战性（Li等人2023）。虽然预扩增技术与CRISPR/Cas结合使用可提高灵敏度，但往往操作复杂、存在污染风险，并且只能提供定性或半定量结果（Chen等人2024b；Fu等人2025；Liu等人2024）。这些限制限制了其在精确定量分析中的应用。相比之下，无需扩增的CRISPR检测方法本质上是定量的且概念更简单，但其灵敏度通常仅限于纳摩尔范围，对于复杂生物样本中的低丰度生物标志物来说不够理想（Talebian等人2024）。因此，在灵敏度和定量准确性之间架起桥梁成为基于CRISPR/Cas的诊断技术的一个关键瓶颈。

为了解决这一挑战，最近的研究致力于提高无需扩增的CRISPR/Cas检测方法的灵敏度（Li等人2023）。这些策略包括优化关键组件（Fozouni等人2021，如crRNA、信号报告分子和工程化的Cas酶），在超局部化的微/纳米反应器中限制反应以增加分子碰撞（Wang等人2023a），构建级联扩增电路（Li等人2025a），以及整合超灵敏的读出方式（Li等人2022）。其中，基于纳米材料的放大器特别有吸引力，因为它们具有高表面积与体积比和易于功能化（Broto等人2022；Chowdhry等人2023；Fu和Xianyu 2023；Wang等人2025b）。通过在高密度下定位识别元件（如抗体、适配体）或CRISPR激活剂，这些纳米放大器显著提高了目标捕获效率并增强了输出信号（Phan等人2022；Sun等人2025；Xiong等人2020）。然而，当功能基团以刚性或拥挤的方式固定时，空间障碍可能会降低Cas酶的活性，从而影响切割效率。因此，需要创新的纳米放大器设计来最大化信号增益，缓解空间限制，并实现灵敏且无需扩增的CRISPR检测。

本文介绍了一种新型的光激活CRISPR/Cas系统LANA，该系统无需扩增即可实现对非核酸目标的定量和灵敏检测。作为概念验证，我们选择了心肌肌钙蛋白I（cTnI）作为模型分析物，它是急性心肌梗死（AMI）的金标准生物标志物。LANA平台使用抗体包覆的磁珠进行目标富集，金纳米颗粒上修饰有cTnI适配体和光解激活剂DNA链，并通过紫外光触发激活剂的释放来启动基于Cas12a的切割反应。该系统实现了高灵敏度的无需扩增的定量cTnI检测，展示了其在分布式检测场景和时效性临床决策支持中的潜力。

章节片段

材料与设备

所有DNA寡核苷酸均由Tsingke公司（中国北京）合成，具体信息见表S1。crRNA（表S1）由GenScript Biotech公司（美国新泽西州）合成。EnGen?Lba Cas12a（Cpf1）（M0653T）和NEBuffer? r2.1购自New England BioLabs公司（美国伊普斯威奇）。磷酸盐缓冲盐水（PBS）、Tris-HCl、NaCl、KCl、MgCl₂、Dithiothreitol（DTT）、Tween20、牛血清白蛋白（BSA）以及不同分子量的聚乙二醇（PEG）等试剂也用于实验。

LANA系统的工作原理

我们开发了一种改进的基于CRISPR/Cas12a的生物传感器LANA，用于直接快速检测非核酸目标。该系统整合了三个功能模块：1）基于免疫磁珠的富集和分离；2）适配体/光解激活剂修饰的金纳米颗粒（apt/pc-act/AuNPs）用于识别和放大；3）光触发的CRISPR/Cas12a介导的信号输出（图1）。选择cTnI作为模型分析物，是因为它对心肌损伤具有高特异性。

结论

我们建立了一种光激活的CRISPR/Cas12a生物传感平台（LANA），用于非核酸生物标志物的定量检测。通过整合免疫磁富集、适配体介导的识别和光控激活剂释放，LANA实现了灵敏、无需扩增的检测流程。以cTnI作为模型目标，该检测方法在血清样本中表现出临床相关的灵敏度、宽动态范围和可靠的性能。

作者贡献声明

尹坤：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、数据分析、概念构思。阮正尚：监督、资金获取、数据分析。李少华：软件支持、资源准备。李燕：资源准备、方法学设计、资金获取。胡琴琴：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、概念构思。李佩辉：初稿撰写、方法学设计、数据分析、数据管理。孙桂荣：监督、方法学设计

利益冲突声明

李佩辉：验证、数据管理、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。胡琴琴：概念构思、方法学设计、资金获取、初稿撰写。李燕：资源准备、审稿与编辑。李少华：资源准备、审稿与编辑。阮正尚：实验设计、资源准备、审稿与编辑。尹坤：实验设计、资源准备、审稿与编辑。孙桂荣：概念构思、方法学设计、监督、资金获取

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2025YFC3409100）、国家自然科学基金（22474076）、上海市卫生健康委员会项目（202340069）、上海东方人才计划（青年项目）、上海市科技创新行动计划（项目编号24J22800900）以及上海交通大学跨学科项目（项目编号YG2024ZD02）的支持。