《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Novel noscapine derivative induces AML differentiation by dual-engaging DHODH and mitochondrial lipids to trigger a metabolic–epigenetic–transcriptional cascade
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急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类异质性强且致死性高的血液系统恶性肿瘤，其特征为分化阻滞和未成熟祖细胞蓄积，因此分化治疗被视为一种有前景的治疗策略。然而，临床成功目前主要局限于急性早幼粒细胞白血病（acute prom
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类异质性强且致死性高的血液系统恶性肿瘤，其特征为分化阻滞和未成熟祖细胞蓄积，因此分化治疗被视为一种有前景的治疗策略。然而，临床成功目前主要局限于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）和异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变型AML，使得大多数AML亚型仍存在未满足的治疗需求。本研究发现了一种新型那可丁衍生物ES428，该化合物可诱导AML分化，并在多种AML细胞系、患者原代样本以及细胞系来源和患者来源异种移植模型中表现出强效抗AML活性。通过组合策略开展靶标去卷积（target deconvolution）后，研究人员鉴定出二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）这一嘧啶从头合成（de novo pyrimidine synthesis）限速酶为其直接功能性靶点。结合分子动力学模拟和系统性构效关系（structure–activity relationship，SAR）研究，阐明了ES428的独特作用机制：其可同时结合DHODH和线粒体膜脂质。该双重结合机制支撑了ES428在生理相关线粒体膜环境中的增强靶标结合、药效和选择性，其潜在原因在于可原位稳定ES428–DHODH相互作用，并促进ES428选择性定位于线粒体。进一步地，ES428触发了一条机制级联，连接嘧啶合成降低、O-连接N-乙酰葡糖胺糖基化（O-linked N-acetylglycosylation，O-GlcNAcylation）减少、EP300/CREBBP催化活性抑制以及转录重编程。本研究鉴定出具有前景的先导候选物，建立了新的DHODH靶向策略，并为推进髓系恶性肿瘤分化治疗提供了重要机制学见解。
该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，围绕急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）分化治疗这一核心问题展开。AML是一类高度异质性的血液系统恶性肿瘤，具有增殖失控、分化停滞以及未成熟髓系祖细胞异常积聚等生物学特征。尽管强化联合化疗和异基因造血干细胞移植仍是目前成人AML的主要治疗方式，但总体5年生存率仍不理想，尤其老年患者预后更差。分化阻滞是AML跨遗传背景共享的重要病理特征，因此分化治疗被认为是具有理论优势的策略。临床上，急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）已经因全反式维甲酸和三氧化二砷的成功应用而成为分化治疗典范，此外IDH突变型AML也从代谢靶向分化治疗中获益。然而，绝大多数非APL且非IDH突变AML亚型依然缺乏有效分化治疗手段，这构成了本研究开展的现实背景与临床需求。
在这一背景下，研究人员从传统药用植物来源天然产物及其衍生物出发，构建聚焦化合物库并进行表型筛选，旨在发现具有AML分化诱导能力的新分子。研究最终鉴定出一种新型那可丁衍生物ES428。与母体化合物那可丁及其经典9′-溴代类似物主要通过微管靶向引发G
2/M期阻滞不同，ES428可在非细胞毒浓度下有效诱导AML细胞分化，并伴随S期阻滞，提示其具备不同于传统那可丁骨架分子的全新作用模式。进一步研究表明，ES428在多种AML细胞系、患者原代AML样本以及异种移植小鼠模型中均表现出显著抗白血病效应，尤其在FAB M4和M5亚型中具有较高敏感性。
为阐明其作用靶点与机制，研究人员采用多层级证据链开展靶点去卷积，最终确认二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）是ES428的直接功能性靶点。DHODH定位于线粒体内膜，是嘧啶从头合成途径中的限速酶，兼具代谢和线粒体生物能耦联属性。已有研究显示，DHODH抑制可使AML细胞摆脱分化阻滞，但临床转化长期受限于疗效、毒性和选择性等问题。该研究的重要创新在于发现ES428不仅与DHODH结合，还可同时与线粒体膜脂质发生相互作用，形成“DHODH–脂质双重结合”模式。这一机制在生理相关的线粒体膜环境中增强了药物–靶标复合物稳定性，并赋予ES428更优的线粒体富集特征，从而提高其靶向效率、药效与选择性，提出了不同于传统DHODH抑制剂的新型靶向范式。
方法概括：研究主要采用天然产物衍生化与表型筛选、AML细胞分化与增殖评估、原代患者样本检测、细胞系来源异种移植和患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型验证体内疗效；结合转录组测序（RNA-seq）、非靶向代谢组学、液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）代谢定量解析作用通路；利用热迁移分析（TSA）、细胞热迁移分析（CETSA）、表面等离子体共振（SPR）、光亲和标记拉下实验和酶学分析确认靶点；并通过分子对接、分子动力学（MD）模拟及系统构效关系（SAR）研究解析结合模式。人源样本来自患者骨髓原代AML单个核细胞，动物实验包括U937细胞异种移植模型及PDX模型。
3.1. Phenotypic screening identified ES428 as a potent AML differentiation inducer
研究人员基于传统药用植物来源天然产物骨架进行定向衍生化，构建约500个结构多样的化合物库，并以ITGAM/CD11b作为髓系分化标志在U937细胞中进行表型筛选，鉴定出ES428为最强分化诱导化合物。后续实验显示，ES428对多种AML细胞系具有广谱抗增殖活性，同时对健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）表现出选择性低毒性，提示存在较佳治疗窗。形态学染色、α-NAE细胞化学染色及CD11b、CD14流式检测共同证实，ES428可在U937和THP-1细胞中诱导典型髓系分化表型，并在HL-60、OCI-AML3等细胞中也具活性。原代患者样本验证显示，ES428在56%样本中诱导分化，在M4/M5亚型中响应率更高，而M2b和M3亚型反应较弱。
3.2. ES428 induces myeloid differentiation and exhibits anti-AML efficacy in murine xenograft models
药代动力学分析显示，ES428具有约7 h半衰期，静脉注射后可达到接近体外有效分化剂量的血浆浓度，并在NCG小鼠中具有良好耐受性。U937-Luc静脉移植模型中，ES428显著降低体内白血病负荷，减轻脾大和多器官白血病浸润，降低脾、骨髓和肝脏中人源白血病细胞比例，并增加骨髓中CD11b阳性分化细胞比例，最终延长小鼠生存期。PDX模型进一步表明，ES428在患者来源白血病中同样可降低浸润并促进分化，支持其体内治疗潜力。
3.3. Multi-omics revealed ES428-induced differentiation associated with pyrimidine biosynthesis inhibition
转录组分析显示，ES428处理后与造血谱系、破骨细胞分化、先天免疫和炎症反应相关通路被持续上调，符合髓系分化表型。与此同时，下调基因富集于代谢相关通路。非靶向代谢组学进一步发现，嘧啶代谢通路在早期及后期均显著受扰动。LC–MS/MS分析确认细胞内尿苷一磷酸（UMP）、尿苷二磷酸（UDP）和尿苷水平均显著下降。功能上，外源尿苷补充可完全逆转ES428诱导的分化及S期阻滞，表明抑制嘧啶生物合成是其抗AML效应的关键上游机制。
3.4. DHODH is identified as ES428’s direct functional target
计算靶标预测、探针设计与实验验证共同指向DHODH。Bodipy标记探针显示ES428具有明显线粒体共定位特征。TSA和CETSA分别在重组蛋白和完整细胞中证实ES428与DHODH结合。光亲和探针ES428-PAP可特异性富集DHODH，并被过量ES428竞争，而无活性类似物和那可丁不能有效竞争。SPR测得ES428与DHODH的KD约为10 μmol/L。酶学实验显示，在重组DHODH体系中ES428抑制活性较弱，但在线粒体分离组分中抑制活性明显增强，提示其药效依赖原生线粒体环境。代谢物检测显示ES428升高二氢乳清酸（DHO）/乳清酸（orotate）比值并降低下游OMP水平。外源orotate、OMP或UMP可逆转分化效应，而底物DHO不能。DHODH过表达可完全消除ES428诱导的分化，DHODH敲除则诱发自发分化并降低对ES428的响应，从功能层面确证DHODH为关键靶点。
3.5. ES428 exerts a unique mechanism of action through dual engagement of DHODH and mitochondrial membrane lipids
针对ES428为何在原生线粒体环境中表现出更高效力，研究人员采用全长DHODH与磷脂酰乙醇胺（PE）脂双层构建分子动力学模型。模拟结果显示，S-ES428在脂质存在时与DHODH的相互作用能显著更稳定，而对照DHODH抑制剂BRQ不受脂质影响。聚类分析揭示，S-ES428一方面结合DHODH的CoQ结合口袋，形成疏水作用、阳离子–π作用、π–π堆积及氢键；另一方面其6位和7位甲氧基可自发插入脂双层，与脂肪酸尾部形成疏水相互作用。系统SAR研究进一步支持这一结合模式：9′位疏水性增强有利于分化诱导与DHODH抑制；6′位取代影响阳离子–π作用；7位疏水修饰优于亲水修饰，支持脂质相互作用的重要性。SPR还证明ES428可直接结合POPC脂质体。整体说明，ES428通过同时结合DHODH与线粒体膜脂质，实现更强靶标结合、线粒体定位和生理环境下更高选择性，构成新型DHODH靶向机制。
3.6. EP300/CREBBP catalytic inhibition-mediated transcriptional regulation is essential for ES428-induced AML differentiation
在下游机制层面，研究人员利用ES428作为化学探针，解析出由代谢改变传递至表观遗传和转录重编程的级联通路。ES428导致全局O-GlcNAcylation下降，补充UDP-GlcNAc可显著逆转分化。研究进一步发现，EP300及其同源蛋白CREBBP存在O-GlcNAc修饰，且ES428可时间依赖性降低其催化产物H3K18Ac和H3K27Ac水平，表明其乙酰转移酶活性受到抑制。尿苷、UDP-GlcNAc和orotate均可恢复这种抑制，而DHO无效，说明EP300/CREBBP活性变化位于DHODH抑制与嘧啶代谢受损之后。药理学上，EP300/CREBBP选择性抑制剂A-485可模拟ES428诱导分化，而激活剂CTPB则抵消ES428效应，证明EP300/CREBBP催化抑制是诱导AML分化的必要环节。
转录调控方面，ES428快速下调Myc的mRNA和蛋白表达，并抑制Myc驱动转录程序；DHODH过表达、orotate补充、尿苷/UDP-GlcNAc补充以及CTPB激活均可恢复Myc表达。Myc过表达则削弱ES428诱导分化，说明Myc抑制是关键下游事件。同时，ES428上调多种髓系分化相关转录因子（TFs）及其靶基因，相关改变可被DHODH过表达或恢复EP300/CREBBP活性所逆转。结果表明，ES428通过“DHODH抑制—嘧啶耗竭—O-GlcNAcylation下降—EP300/CREBBP催化抑制—Myc抑制及分化型TF网络激活”这一代谢–表观遗传–转录轴驱动AML细胞分化。
讨论部分表明，该研究的核心贡献在于三个层面。其一，从药物发现角度，研究将天然产物骨架重定位与表型筛选结合，发现了可诱导AML分化的新型那可丁衍生物ES428。其二，从靶向机制角度，研究提出DHODH并非仅作为可溶性酶靶点理解，而应纳入其线粒体膜相关原生环境；ES428所体现的DHODH–脂质双重结合模式，为提升膜相关靶点药物的效力、选择性与安全性提供了可推广思路。其三，从生物学机制角度，研究系统连接了嘧啶代谢、O-GlcNAc糖基化、EP300/CREBBP乙酰转移酶活性以及Myc和分化相关转录因子网络，揭示了DHODH抑制驱动AML分化的较完整分子路径。研究同时指出，M4/M5亚型可能因较低OGT和Myc水平及较高分化相关TF表达而处于更易分化的“预激活”状态，而M2b、M3亚型则表现出相对耐受。
研究结论部分可译为：ES428已被鉴定为一种强效的AML分化诱导剂，并已在体外和体内得到验证，尤其在FAB M4和M5亚型中表现突出。其独特机制在于同时结合DHODH与线粒体脂质。这种双重结合可在原位稳定ES428–DHODH相互作用，并促进ES428选择性靶向线粒体，从而在生理环境中增强治疗效力和选择性。ES428可协调一条下游代谢–表观遗传–转录轴，将嘧啶耗竭、EP300/CREBBP催化抑制以及转录重编程联系起来并驱动分化。本研究提出了有前景的先导候选物，并为拓展髓系恶性肿瘤分化治疗提供了新的机制学与转化研究见解。
